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Oct 21, 2023

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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 13609 (2023) Diesen Artikel zitieren 220 Zugriffe 1 Altmetric Metrics Details Verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Membranverkehr, Lipidhomöostase,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13609 (2023) Diesen Artikel zitieren

220 Zugriffe

1 Altmetrisch

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Verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Membranverkehr, Lipidhomöostase, Zytokinese, mitochondriale Positionierung und Zellmotilität, hängen entscheidend vom Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor GBF1 der Sec7-Domäne ab. Es ist jedoch unbekannt, wie die Beteiligung von GBF1 an einer bestimmten Zellfunktion reguliert wird. Hier zeigen wir, dass die Phosphorylierung spezifischer hochkonservierter Serin- und Tyrosinreste innerhalb der N-terminalen Domäne von GBF1 seine Funktion bei der Aufrechterhaltung der Golgi-Homöostase und der Erleichterung der Sekretion im Vergleich zu seiner Rolle bei der Zytokinese unterschiedlich reguliert. Insbesondere GBF1-Mutanten, die einzelne Aminosäuresubstitutionen enthalten, die ein stabil phosphoryliertes S233, S371, Y377 und Y515 nachahmen, oder die S233A-Mutante, die nicht phosphoryliert werden kann, sind bei der Beurteilung vollständig in der Lage, die Golgi-Architektur aufrechtzuerhalten und den Frachtverkehr über den sekretorischen Weg zu unterstützen mehrere funktionelle Tests. Dieselben Mutanten verursachen jedoch bei Expression in Zellen eine Mehrkernbildung und scheinen das Fortschreiten durch Mitose und die Auflösung zytokinetischer Brücken zu hemmen. Somit beteiligt sich GBF1 an verschiedenen interaktiven Netzwerken, wenn es die Golgi-Homöostase und -Sekretion vermittelt oder die Zytokinese erleichtert, und die Integration von GBF1 in solche Netzwerke wird durch die Phosphorylierung spezifischer GBF1-Reste unterschiedlich reguliert.

Die zelluläre Homöostase hängt von streng kontrollierten Schaltkreisen ab, die als Reaktion auf interne und externe Signale verschiedene Prozesse in Gang setzen und koordinieren. Die Integration des zellulären Stoffwechsels, des genetischen und des physiologischen/biochemischen Zustands wird kontinuierlich überwacht und zur systemweiten Synchronisierung aneinander weitergeleitet. Um sicherzustellen, dass Prozesse zeitlich und räumlich koordiniert werden, haben sich eindeutige Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen entwickelt. Der Sekretionsweg, der aus einer Reihe unterschiedlicher Kompartimente besteht, ist streng reguliert, um einen kompensatorischen anterograden und Recycling-Verkehr von Membran- und ausgewählten Proteinen sicherzustellen, um einen kontinuierlichen Transport sicherzustellen.

Einer der wichtigsten Regulatoren des Sekretionswegs sind die kleinen GTPasen der Arf-Superfamilie, die den Verkehr an der ER-Golgi-Schnittstelle erleichtern1,2,3,4,5. Arfs sind wichtig, um die heptameren Coatomer-Mantelkomplexe an Golgi-Membranen zu rekrutieren und COPI-Vesikel zu bilden, die Proteine ​​und Membranen vom Golgi zum ER6,7,8,9 recyceln. Alle Arfs wechseln zwischen GDP- und GTP-gebundenen Zuständen und sind nur dann funktionsfähig und membranassoziiert, wenn sie sich in ihrem GTP-gebundenen (aktiven) Zustand befinden10. Der GDP/GTP-Austausch ist kinetisch ungünstig (um eine unerwünschte Arf-Aktivierung zu verhindern) und erfordert ein Enzym, einen Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF), um die Verdrängung des GDP zu katalysieren und so die Bindung des aktivierenden GTP an den Arf zu ermöglichen. Der für die COPI-Vesikelbildung verantwortliche GEF ist der Golgi-spezifische Brefeldin-A-Resistenzfaktor 1 (GBF1), der sich in den Kompartimenten an der ER-Golgi-Grenzfläche befindet, einschließlich ER-Austrittsstellen, ER-Golgi-Zwischenkompartiment (ERGIC) und Golgi11. 12. GBF1 ist für die Aktivierung von Arfs, die zur Aufrechterhaltung der Architektur und Funktion des Sekretionswegs erforderlich sind, unbedingt erforderlich. Die Störung der GBF1-Aktivität durch den Pilzmetaboliten Brefeldin A (BFA) oder die Erschöpfung von zellulärem GBF1 durch RNAi führt zum Kollaps von Golgi in das ER und hemmt Sekretion11,13,14,15,16.

Zusätzlich zu seiner gut charakterisierten Rolle bei der Golgi-Homöostase und dem sekretorischen Verkehr scheint GBF1 an einer Vielzahl anderer zellulärer Ereignisse beteiligt zu sein, die räumlich vom Golgi entfernt sind. GBF1 zielt auf die Vorderkante der Plasmamembran in sich aktiv bewegenden Glioblastomzellen und chemotaxierenden Neutrophilen, wo seine katalytische Aktivität für die Aufrechterhaltung der Richtungsmotilität in einem Prozess, der den durch Rac1 erleichterten kortikalen Aktin-Umbau beinhaltet, von wesentlicher Bedeutung ist17,18. GBF1 reguliert negativ die Bildung von Lipidtröpfchen (LD) und den zellulären Triacylglyceringehalt19, vermutlich durch die Erleichterung der Abgabe von ATGL (Fetttriglyceridlipase) an LDs durch eine direkte Wechselwirkung zwischen GBF1 und ATGL20. Die GBF1-vermittelte Regulierung der LD-Homöostase scheint wichtig zu sein, um die erfolgreiche Replikation von Viren wie dem Dengue-Virus21 zu unterstützen. GBF1 interagiert auch mit dem mitochondrialen Membranprotein MIRO, um dessen Interaktionen mit den zytoplasmatischen Dyneinmotoren zu modulieren und dadurch die Positionierung der Mitochondrien zu regulieren sowie die intra-mitochondriale Cristae-Architektur durch einen noch nicht charakterisierten Mechanismus zu beeinflussen22. Die Funktion der mitochondrialen Positionierung bleibt in der Evolution erhalten, wie analoge Phänotypen zeigen, die durch die GBF1-Entfernung im Wurm C. elegans und in Säugetierzellen verursacht werden23. Darüber hinaus wurde GBF1 mit noch nicht verstandenen Funktionen während der Mitose24,25,26,27 in Säugetierzellen in Verbindung gebracht, was die Septationsdefekte stützt, die zuvor bei S. pombe beschrieben wurden, bei dem eine Kopie von Gea1, dem Hefeortholog von GBF128, gelöscht wurde. In Säugetierzellen, die eine Mitose durchlaufen, wird GBF1 durch CK2 in der späten Anaphase und frühen Telophase an S292 und S297 phosphoryliert, und so scheint sich phosphoryliertes GBF1 im Fleming-Körper der zytokinetischen Brücke zu lokalisieren. Das S292/297-phosphorylierte GBF1 wird während der späten Telophase abgebaut, die gesamten zellulären GBF1-Spiegel ändern sich jedoch nicht, was darauf hindeutet, dass nur ein kleiner Teil des GBF1 auf S292 und S297 phosphoryliert und anschließend abgebaut wird. Die Verhinderung der Phosphorylierung und des Abbaus durch die Expression von S292A und S297A führt zu mitotischen Defekten in Zellen, wobei Golgi-Elemente in der späten Mitose nicht richtig zusammenwachsen. In Zellen, die S292A/S297A exprimieren, wird die zytokinetische Brücke destabilisiert, was zu ihrem Zusammenbruch und der Bildung zweikerniger Zellen führt26.

Während die Regulierung der Golgi-Homöostase und des sekretorischen Transports die Hauptfunktionen von GBF1 sind, deuten die Studien, die die Bedeutung von GBF1 in anderen Prozessen, einschließlich der Mitose, beschreiben, darauf hin, dass GBF1 viele verschiedene Funktionen in einer Zelle ausführt. Dies impliziert die Existenz molekularer Mechanismen, die die Beteiligung von GBF1 an bestimmten Prozessen regulieren. Die Determinanten, die die Bereitstellung von GBF1 in einem bestimmten Prozess steuern, wurden jedoch noch nicht untersucht.

Hier berichten wir, dass die Phosphorylierung ausgewählter Serin- und Tyrosinreste in der N-terminalen Region von GBF1 stromaufwärts der zentral gelegenen katalytischen Sec7-Domäne (Sec7d) die Fähigkeit von GBF1, bestimmte Zellfunktionen zu unterstützen, unterschiedlich beeinflusst. Wir haben Phospho-Omics-Daten durchsucht, um konsistent erkannte Phosphorylierungsstellen innerhalb von GBF1 zu identifizieren, und nur diejenigen ausgewählt, die in GBF1-Orthologen konserviert sind, für die Analyse29. Unter Verwendung einzelner Aminosäuresubstitutionen spezifischer Reste berichten wir, dass phosphomimetische Substitutionen von Serin 233 (S233D), Serin 371 (S371D), Tyrosin 377 (Y377E) und Tyrosin 515 (Y515E) die GBF1-Funktion bei der Aufrechterhaltung der Golgi-Homöostase nicht beeinflussen und die Sekretion erleichtern, verursachen jedoch schwere Störungen bei der Zellteilung. Die Zellteilung wird auch durch die Substitutionen S233A und Y515C gehemmt, die die Phosphorylierung verhindern. Die Defekte treten spät während der Mitose auf und beeinflussen die Zytokinese, da die fehlende Abszision interzellulärer Brücken zur Bildung von zwei- und mehrkernigen Zellen führt.

Unsere Ergebnisse zeigen zum ersten Mal einen unterschiedlichen Bedarf an einer bestimmten posttranslationalen Modifikation als Schlüsselfaktor für die GBF1-Funktionalität in einem bestimmten zellulären Prozess. Unsere Phosphorylierungsmutanten stellen einzigartige Präzisionswerkzeuge dar, die im krassen Gegensatz zu den bisher verwendeten Ansätzen der GBF1-Inaktivierung oder -Entfernung stehen, die alle zellulären Funktionen von GBF1 beeinflussen. Unsere Fähigkeit, GBF1-Mutanten zu erzeugen, die in einigen, aber nicht allen GBF1-Funktionen beeinträchtigt sind, bildet eine entscheidende Grundlage für zukünftige Studien, um die molekularen Parameter der Rolle von GBF1 im Sekretionsweg von seiner Aktivität während der Zytokinese zu trennen.

Die Stabilität, Lokalisierung und Funktion von Proteinen wird häufig durch reversible Phosphorylierungen von Serin- (S), Threonin- (T) und Tyrosin- (Y) Resten reguliert, die entweder die Protein-Protein-Bindung hemmen oder vorübergehende Bindungsstellen für kritische Wechselwirkungen erzeugen. Wir haben zuvor webbasierte Phospho-Omics-Datenbanken wie PhosphoSitePlus und PhosphoNET abgefragt und über die Verteilung der GBF1-Phosphorylierungsstellen innerhalb verschiedener Domänen dieses Multidomänenproteins berichtet29. Hier haben wir uns auf konservierte Phosphorylierungsstellen in der N-terminalen Region von GBF1 vor Sec7d konzentriert (Abb. 1a, die ausgewählten Stellen sind in der umrahmten Region blau dargestellt). Diese Untergruppe von Phosphorylierungsstellen wurde basierend auf dem Grad der Konservierung unter den GBF1-Orthologen ausgewählt (Abb. 1b, Reste rot schattiert; phosphorylierte Reste 599–662 werden nicht angezeigt, da sie nicht konserviert sind). Einige der ausgewählten Phosphorylierungsstellen sind nur bei Wirbeltierarten konserviert (S233 und S371), während andere Stellen bei so unterschiedlichen Arten wie Menschen, Mäusen, Zebrafischen, Fliegen und Würmern (S174, S349, S352, Y377 und Y515) konserviert sind. (Abb. 1b). Das hohe Maß an Konservierung innerhalb der GBF1-Orthologen legt nahe, dass die posttranslationale Phosphorylierung dieser Reste für die GBF1-Funktion relevant sein könnte.

GBF1-Phosphorylierungsstellen, die zwischen den Arten konserviert und in dieser Studie analysiert wurden. (a) Domänenarchitektur von GBF1 mit allen gemeldeten Phosphorylierungsstellen. Die für diese Studie ausgewählten hochkonservierten N-terminalen Reste sind blau im rot umrandeten Bereich. Alle in dieser Studie verwendeten Konstrukte enthalten die A795E-Substitution (in Rot), um sie BFA-resistent zu machen. Rückstände, die während der Mitose durch CK2 oder AMPK phosphoryliert werden, sind violett. (b) Ausrichtungen von menschlichem GBF1 mit GBF1-Orthologen von Mäusen, Zebrafischen, Würmern und Fruchtfliegen, die konservierte Reste zeigen (blau schattiert). Die in dieser Studie mutierten S- und Y-Reste sind rot schattiert. Reste innerhalb der DCB- und HUS-Domänen sind grün eingerahmt. (c) Von AlphaFold vorhergesagte Struktur des menschlichen GBF1-Monomers, wobei die in dieser Studie untersuchten Phosphorylierungsstellen durch schwarze Pfeile gekennzeichnet sind. Ein roter Pfeil zeigt auf den A795-Rest innerhalb der katalytischen Sec7-Domäne, der bei Mutation zu E BFA-Resistenz verleiht.

Basierend auf der von AlphaFold vorhergesagten Struktur des GBF1-Monomers befinden sich nur zwei der sieben Phosphorylierungsstellen in hochstrukturierten Domänen (S174 in DCB und Y515 in HUS) (Abb. 1c, Pfeile). Es wird vorhergesagt, dass beide Reste an der Oberfläche exponiert sind (S174 befindet sich in einer Schleife zwischen α-Helix 6 und 7 von DCB und Y515 befindet sich in einer Schleife zwischen α-Helix 4 und 5 von HUS). Die verbleibenden 5 Phosphorylierungsstellen sind in der relativ schlecht konservierten Linkerregion zwischen den DCB- und HUS-Domänen geclustert, was darauf hindeutet, dass selbst die weniger strukturierten Regionen von GBF1 möglicherweise regulatorische posttranslationale Modifikationen enthalten, die sich auf selektive Wechselwirkungen von GBF1 mit seinen Partnerproteinen auswirken könnten.

Um die Rolle der Phosphorylierung bei der GBF1-Funktion zu beurteilen, haben wir zwei Mutanten für jede Phosphorylierungsstelle erzeugt – eine Änderung zu Alanin (A), einem Rest, der nicht phosphoryliert werden kann, und eine Änderung zu einem Phospho-Mimetikum, Asparaginsäure (D). für phosphoryliertes Serin (S) und Glutaminsäure (E) für phosphoryliertes Tyrosin (Y)30. Wir sind uns bewusst, dass die Mutation eines phosphorylierten Rests mehr als nur seine Funktion als Phospho-Akzeptor beeinträchtigen kann und dass der Ersatz solcher Reste durch negativ geladene Aminosäuren den phosphorylierten Rest in funktioneller Hinsicht möglicherweise nicht nachahmen kann. Hier verwenden wir die Terminologie der Phosphorylierung, während wir die Mutationsanalyse einer phosphorylierten Stelle diskutieren. Aus technischen Gründen wurde Y515 zu Cystein (C) anstelle von A mutiert, einem Rest, der ebenfalls nicht phosphoryliert werden kann.

Die Expression jedes Konstrukts nach der Transfektion in HeLa-Zellen wurde durch Western Blot mit Anti-GFP-Tag-Antikörpern bewertet, um das Venus-markierte Konstrukt und Anti-GAPDH als Ladungskontrolle nachzuweisen. Wie in Abb. 2b und der ergänzenden Abb. S1 gezeigt, produzierte jedes Konstrukt das Protein mit dem entsprechenden Molekulargewicht. Da alle Konstrukte N-terminal markiert sind und der Western Blot mit Anti-Tag-Antikörpern durchgeführt wurde, deutet dies darauf hin, dass in den Zellen nur Proteine ​​voller Länge vorhanden sind, ohne Fragmentierung oder teilweise Verdauung. Die Gesamtexpressionsniveaus der meisten Konstrukte ähnelten denen des A795E-Konstrukts, das in dieser Analyse als Wildtyp betrachtet wurde, wobei drei Konstrukte (S233A, S352A und Y377E) eine geringere Gesamtexpression zeigten.

Golgi-Targeting von Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle. (a) HeLa-Zellen wurden mit Venus-markiertem GBF1 oder einer Mutante der GBF1-Phosphorylierungsstelle transfiziert, und nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert und mit Anti-GFP gefärbt, um transfizierte Zellen zu erkennen, und Anti-GM130, um die Golgi-Zellen sichtbar zu machen (Kerne sind gefärbt). mit DAPI). Repräsentative Bilder von Zellen, die mit Wildtyp-GBF1 oder den angegebenen Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle transfiziert wurden, zeigen Golgi- und zytosolische Färbung. (b) HeLa-Zellen wurden mit Venus-markiertem GBF1 oder einer Mutante der GBF1-Phosphorylierungsstelle transfiziert, und nach 24 Stunden wurden die Zellen lysiert und die Lysate durch SDS-PAGE und Immunblotting mit Anti-GFP- und Anti-GAPDH-Antikörpern analysiert. In den mit jedem Konstrukt transfizierten Zellen wird ein Protein voller Länge mit dem entsprechenden Molekulargewicht exprimiert. Die Blots wurden vor der Inkubation mit Antikörpern geschnitten. (c) Bilder analog denen in (a) wurden verwendet, um die GFP-Pixelintensität zu messen, die zusammen mit GM130 im Verhältnis zur GFP-Pixelintensität der gesamten Zelle lokalisiert war, um den Prozentsatz des gesamten zellulären GFP-Signals am Golgi zu erhalten. Die Ergebnisse stammen von 3 unabhängigen Transfektionen und jeder Punkt stellt Ergebnisse einer einzelnen transfizierten Zelle dar. Die Targeting-Effizienz von GBF1-Phosphorylierungsmutanten im Vergleich zu der von Wildtyp-GBF1 wurde mithilfe des Student-t-Tests verglichen. N ≥ 15. P < 0,1 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***), P < 0,0001 (****).

Die Auswirkungen der Mutation spezifischer Phosphorylierungsstellen auf die Fähigkeit von GBF1, auf den Golgi zu zielen, wurden bewertet, indem die Menge der exogen exprimierten Venus-markierten GBF1-Mutante am Golgi als Prozentsatz des exprimierten Proteins in der gesamten Zelle gemessen wurde. Repräsentative Bilder von HeLa-Zellen, die mit Venus-markiertem GBF1 oder der angegebenen Phosphorylierungsmutante transfiziert und mit Anti-GFP zum Nachweis transfizierter Zellen und des GM130-Golgi-Markers gefärbt wurden, sind in Abb. 2a dargestellt. In dieser Studie enthält Wildtyp-GBF1 (A795E) eine Alanin-zu-Glutamat-Substitution in der katalytischen Sec7-Domäne, die Resistenz gegen Brefeldin A (BFA) verleiht, weist jedoch unveränderte Phosphorylierungsstellen auf und gilt als Wildtyp. Alle unsere Phosphorylierungsmutanten enthalten die A795E-Mutation und sind alle resistent gegen BFA.

Für jede Phosphorylierungsmutante in dieser Studie wurde eine Golgi-Targeting-Analyse durchgeführt und die Bilder wurden zur Quantifizierung der Targeting-Effizienz verwendet. Aufgrund der leicht unterschiedlichen Expressionsniveaus der verschiedenen Konstrukte in einzelnen Zellen haben wir zunächst die Beziehung zwischen dem Niveau der GBF1-Expression und dem Prozentsatz des zellulären GBF1 untersucht, der mit dem Golgi in Zellen assoziiert, die unterschiedliche Niveaus von GBF1 exprimieren. Fünf Zellen (aus drei verschiedenen Bildern), die A795E in niedrigen (gelbe Sternchen in ergänzender Abbildung S2), mittleren (blaue Sternchen in ergänzender Abbildung S2) und hohen (rote Sternchen in ergänzender Abbildung S2) exprimieren, wurden auf den Prozentsatz untersucht. des gesamten zellulären GBF1, das am Golgi vorhanden ist. Wir fanden heraus, dass die prozentuale Golgi-Assoziation in Zellen, die niedrige bis mittlere Mengen an GBF1 exprimierten, linear erschien (ergänzende Abbildung S2). In unseren Golgi-Targeting-Analysen wurden nur Bilder von Zellen mit geringen bis mäßigen Expressionsniveaus jedes GBF1-Konstrukts verwendet (analog zu Zellen, die in der ergänzenden Abbildung S2 mit gelben und blauen Sternchen markiert sind). Wie in Abb. 2c gezeigt, weisen die meisten Phosphorylierungsmutanten im Vergleich zum A795E-Wildtyp-GBF1 ein verringertes Targeting auf. Die gefährdetsten Mutanten sind Y377A, Y377E und Y515C. Es ist von besonderem Interesse, dass Y377 und Y515 beide in GBF1-Orthologen hoch konserviert sind. Die Konservierung spiegelt häufig den evolutionären Druck wider, interaktive Schnittstellen aufrechtzuerhalten, was darauf hindeutet, dass Y377 und Y515 möglicherweise Schnittstellen für die GBF1-Bindung an Membrankomponenten bilden.

Die strukturelle Integrität von Golgi erfordert eine GBF1-abhängige Arf-Aktivierung, da die Hemmung oder Erschöpfung von GBF1 zur Golgi-Fragmentierung führt16,31,32. Um die Fähigkeit jedes Mutanten zur Aufrechterhaltung der Golgi-Morphologie zu beurteilen, verwendeten wir einen zellulären GBF1-Ersatztest, der auf der durch die A795E-Mutation innerhalb der katalytischen Sec7-Domäne verliehenen BFA-Resistenz basierte. Alle in dieser Studie verwendeten Konstrukte enthalten die A795E-Mutation und sind daher BFA-resistent. In diesem Assay zeigen nicht transfizierte Zellen dispergiertes Golgi aufgrund der Inaktivierung von endogenem GBF1. Im Gegensatz dazu behalten Zellen, die Wildtyp-GBF1 mit der A795E-Mutation exprimieren, kompakte Golgi-Zellen bei, was die Funktionalität des exogen exprimierten GBF1-Konstrukts widerspiegelt33. HeLa-Zellen wurden mit GBF1/A795E oder jedem Phosphorylierungsmutanten, der die A795E-Substitution enthielt, transfiziert und nach 24 Stunden 1 Stunde lang mit BFA behandelt, um das endogene GBF1 zu inaktivieren. Anschließend wurden die Zellen mit Anti-GFP gefärbt, um transfizierte Zellen zu erkennen, und mit Anti-GM130, um die Golgi-Morphologie sichtbar zu machen. Wie in Abb. 3a gezeigt, zeigen Zellen, die GBF1 oder die Y377E-Phosphorylierungsmutante (beide enthalten die A795E-Substitution) exprimieren, die charakteristische intakte Golgi-Bandmorphologie, was darauf hinweist, dass beide die Golgi-Architektur unterstützen. Im Gegensatz dazu zeigen Zellen, die die Phosphorylierungsmutanten S174A, S174D oder Y515C (alle mit der A795E-Substitution) exprimieren, wie in Abb. 3b gezeigt, ein etwas stärker verteiltes Muster von Golgi-Elementen, was darauf hindeutet, dass diese Konstrukte funktionell beeinträchtigt sind.

Spezifische Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle zeigen eine verringerte Fähigkeit, die Golgi-Architektur zu unterstützen. HeLa-Zellen wurden mit Venus-markiertem Wildtyp-GBF1 oder der angegebenen Mutante der Phosphorylierungsstelle transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 1 Stunde lang mit BFA behandelt, um das endogene GBF1 zu inaktivieren. Die Zellen wurden fixiert und mit Anti-GFP gefärbt, um transfizierte Zellen zu erkennen, und mit Anti-GM130, um die Golgi-Morphologie zu beurteilen (Kerne werden mit DAPI gefärbt). (a) Repräsentative Bilder von Zellen, die den Venus-markierten Wildtyp-GBF1 oder die Y377E-Mutante exprimieren, die den charakteristischen kompakten Golgi in den transfizierten Zellen zeigen. Beachten Sie die BFA-induzierte Fragmentierung des Golgi in nicht transfizierten Zellen. (b) Repräsentative Bilder von Zellen, die Venus-markiertes S174A, S174D oder die Y515C-Mutante exprimieren, die teilweise dispergierte Golgi-Elemente in den transfizierten Zellen zeigen. (c) Bilder analog zu denen in (a) und (b) wurden analysiert und die Größenverteilung von Golgi puncta in Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimieren, im Vergleich zu jeder Mutante der GBF1-Phosphorylierungsstelle aus drei separaten Experimenten wird als Häufigkeitsverteilung dargestellt.

Analoge Bilder wurden verwendet, um die Größenverteilung von Golgi-Elementen in Zellen zu beurteilen, die jede der Phosphorylierungsmutanten exprimieren, und die Ergebnisse werden als Häufigkeitsverteilungen dargestellt (Abb. 3c). Die Mehrzahl der Mutanten der Phosphorylierungsstelle waren in der Lage, die normale Golgi-Architektur aufrechtzuerhalten, wenn sie als einziges funktionelles GBF1 in der Zelle vorhanden waren. In Zellen, die die Mutanten S174A, S174D und Y515C exprimierten, wurde jedoch eine höhere Häufigkeit kleinerer Golgi-Strukturen beobachtet. Dieses Ergebnis legt nahe, dass diese Mutanten möglicherweise teilweise in ihrer Funktion beeinträchtigt sind. Der Defekt könnte durch das verminderte Golgi-Targeting dieser Mutanten verursacht werden (Abb. 2b). Im Gegensatz dazu zeigten Zellen, die die Y515E-Mutante exprimierten, eine Verschiebung der Häufigkeitsverteilung hin zu größeren Golgi-Strukturen, obwohl dieses Konstrukt auch ein verringertes Golgi-Targeting aufwies.

Wir haben zuvor gezeigt, dass die Expression der katalytisch inaktiven GBF1/E794K7- oder GBF1/7A34-Mutanten, die mit dem endogenen GBF1 um Golgi-Bindungsstellen konkurrieren, die Golgi-Architektur stört. Um festzustellen, ob Phosphorylierungsmutanten möglicherweise einen dominanten negativen Effekt in Zellen haben, haben wir untersucht, ob die Mutanten die Golgi-Architektur in Zellen stören könnten, die funktionelles endogenes GBF1 enthalten. HeLa-Zellen wurden mit Venus-markiertem GBF1 oder jeder Mutante der Phosphorylierungsstelle transfiziert und nach 24 Stunden mit Anti-GFP zum Nachweis transfizierter Zellen und mit Anti-GM130 zur Visualisierung der Golgi-Architektur gefärbt. Die Golgi-Intaktheit wurde durch Messen der Anzahl von Golgi-Elementen einer bestimmten Größe (der Größenhäufigkeitsverteilung) in Zellen, die eine bestimmte Phosphorylierungsmutante exprimierten, im Vergleich zu der in Zellen, die den Wildtyp-GBF1 exprimierten, beurteilt (Abb. 4). Insgesamt war die Häufigkeit von Golgi-Elementen einer bestimmten Größe in Zellen, die Wildtyp-GBF1 oder die Phosphorylierungsmutanten exprimierten, ähnlich, wobei die Hauptpeaks entweder vollständige Überlappung oder große Nähe zeigten. Eine leichte Verschiebung hin zu einer höheren Häufigkeit kleinerer Golgi-Elemente wurde in Zellen beobachtet, die die Mutanten S233A, S233D, S352A und Y515E exprimierten. Allerdings wurde selbst in diesen Zellen die perinukleäre Position des Golgi nicht verändert (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die kleineren Golgi-Fragmente tatsächlich Dyneinmotoren aktivieren und sich in (-)-Richtung in Richtung der perinukleären Mikrotubuli-Organisation bewegen Center. Insgesamt scheinen die Phosphorylierungsmutanten keine signifikanten dominanten negativen Auswirkungen auf die Golgi-Architektur zu haben.

Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle wirken nicht dominant negativ. HeLa-Zellen wurden mit Venus-markiertem Wildtyp-GBF1 oder der angegebenen Mutante der Phosphorylierungsstelle transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert und mit Anti-GFP angefärbt, um transfizierte Zellen sichtbar zu machen, und mit Anti-GM130, um die Golgi-Morphologie zu beurteilen. Die Größenverteilung von Golgi puncta in Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimieren, im Vergleich zu jeder Phosphorylierungsmutante aus drei separaten Experimenten wird als Häufigkeitsverteilung dargestellt.

Die Unfähigkeit einiger GBF1-Mutanten, effizient auf den Golgi zu zielen oder eine kompakte Golgi-Architektur aufrechtzuerhalten, warf die Frage auf, ob solche Mutanten die Golgi-Dynamik verändern und/oder die Fusionsereignisse verringern könnten, die zum Zusammenfügen von Golgi-Fragmenten zu einem Band erforderlich sind. Um das Verhalten von Golgi-Strukturen in Zellen zu messen, die unterschiedliche Phosphorylierungsmutanten exprimieren, wurden HeLa-Zellen, die das GFP-markierte Golgi-Enzym Galactosyltransferase (GalT) stabil exprimieren, mit jedem Tomaten-markierten Phosphorylierungskonstrukt (alle enthalten die A795E-Substitution) 24 Stunden lang transfiziert und behandelt mit BFA für 30 Minuten, um endogenes GBF1 zu hemmen, und dann 1 Stunde lang in Gegenwart von BFA live abgebildet. Die räumlich-zeitlichen Daten wurden in einem einzigen Zeitverlaufsstapel zusammengefasst, aufgeteilt, um die GFP- (GalT) und die DsRed-Emissionen (Phosphorylierungsmutante) zu extrahieren, und die Dynamik einzelner Golgi-Strukturen wurde farblich kodiert. Die Farbe spiegelt die Dynamik jeder Struktur wider, wobei weiße Puncta minimale Bewegung zeigen, während mehrfarbige Puncta Strukturen mit unterschiedlichen Beweglichkeiten während der Bildgebung anzeigen. Wie in Abb. 5a gezeigt, enthalten Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimieren, einen stationären Golgi-Kern (in Weiß) mit zahlreichen weiter entfernten Golgi-Punkten (in mehreren Farben), was auf eine häufige Hin- und Herbewegung der Elemente hinweist. Im Gegensatz dazu enthalten Zellen, die die Phosphorylierungsmutanten S233A (Abb. 5b), S371D (Abb. 5c), Y377E (Abb. 5d), Y515C (Abb. 5e) und Y515E (Abb. 5f) exprimieren, überwiegend weiße Golgi-Kerne mit weniger mehrfarbige Golgi-Punkte, was auf eine verringerte Dynamik der Golgi-Fragmente schließen lässt. Die Nachschlagetabelle, die die Farben in jedem einzelnen Frame anzeigt, ist in Abb. 5g dargestellt. Einige der Panels enthalten Zellen, die scheinbar nicht transfiziert sind, aber über intakte Golgi-Zellen verfügen. Tatsächlich exprimieren jedoch alle Zellen, die intaktes Golgi enthalten, exogenes GBF1, wenn die Intensität des roten Signals erhöht wird (Daten nicht gezeigt).

Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle verursachen Veränderungen in der Golgi-Dynamik. HeLa-Zellen, die GFP-markiertes GalT stabil exprimieren, wurden 24 Stunden lang mit jeder Tomaten-markierten Phosphorylierungsstellenmutante transfiziert, 30 Minuten lang mit BFA behandelt, um endogenes GBF1 zu hemmen, und dann 1 Stunde lang in Gegenwart von BFA live abgebildet. Die Bilder aus jedem Lauf wurden zu einem einzigen Zeitverlaufsstapel zusammengefasst und die Dynamik einzelner Golgi-Strukturen wurde farblich kodiert, wobei weiße Punkte minimale Bewegung zeigten, während mehrfarbige Punkte Strukturen mit unterschiedlichen Beweglichkeiten während der Bildgebung markieren. (a–g) Linke Felder: die Lokalisierung jedes Konstrukts zu Beginn der Live-Bildgebung. Rechte Felder: verarbeitetes Bild, das die Bewegung der Golgi-Punkte auf der Grundlage der Jet-Nachschlagetabelle (g) zeigt und Farben anzeigt, die mit der Bewegung in nachfolgenden Bildern verbunden sind. Weiße Pfeile zeigen auf Zellen, die Wildtyp-GBF1 oder eine Mutante der GBF1-Phosphorylierungsstelle exprimieren.

Die verringerte Fähigkeit einiger GBF1-Phosphorylierungsmutanten, die Golgi-Architektur und die normale Golgi-Dynamik zu unterstützen, veranlasste uns zu analysieren, ob die Sekretion in Zellen, die diese Konstrukte exprimieren, beeinträchtigt sein könnte. Die Sekretion einer Ladung (ein Fragment der Gaussia-Luciferase, fusioniert mit einem Leader-Peptid) wurde in HeLa-Zellen in einem zellulären „Ersatz“-Assay überwacht. In diesem Assay wurden HeLa-Zellen mit dem Gaussia-Plasmid und entweder A795E (Kontroll-GBF1), einem Phosphorylierungsmutanten, der die A795E-Substitution enthielt, oder einem leeren Vektor (Kontrollvektor) co-transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen in frisches Medium gegeben, das unterschiedliche BFA-Konzentrationen enthielt, um das endogene GBF1 zu inaktivieren, und die Sekretion von Luciferase wurde über die nächsten 4 Stunden in Gegenwart von BFA überwacht, um die exogen exprimierte GBF1-Mutante zur einzigen funktionellen GBF1-Spezies zu machen . Wie in Abb. 6 gezeigt, sezernieren Zellen, die A795E (Kontroll-GBF1) exprimieren, selbst in Gegenwart der höchsten BFA-Konzentration Luciferase, während mit einem leeren Vektor (Kontrollvektor) transfizierte Zellen selbst bei der niedrigsten BFA-Konzentration in der Sekretion gehemmt werden.

Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle unterstützen die normale Proteinsekretion. HeLa-Zellen wurden mit einem Gaussia-Luciferase-Reporter und entweder Wildtyp-GBF1 (Kontroll-GBF1), der angegebenen Mutante der Phosphorylierungsstelle oder einem leeren Vektor (Kontrollvektor) co-transfiziert. Nach 24 Stunden wurde das Medium gegen ein Medium ausgetauscht, das die angegebene BFA-Konzentration enthielt (um endogenes GBF1 zu inaktivieren), und die in das Medium freigesetzte Menge an Luciferase wurde nach 4 Stunden gemessen. Daten für den nicht phosphorylierbaren und einen phosphomimetischen GBF1-Mutanten an jeder Phosphorylierungsstelle sind in einem Kasten zusammengefasst.

Zellen, die jedes Phosphorylierungskonstrukt exprimierten (alle enthalten die A795E-Substitution), zeigten selbst bei der höchsten BFA-Konzentration analoge Sekretionsniveaus wie A795E. Selbst bei Zellen, die Phosphorylierungsmutanten exprimierten, die teilweise bei der Unterstützung der Golgi-Homöostase beeinträchtigt waren, wurden normale Sekretionsniveaus beobachtet. Dies stimmt mit früheren Daten überein, die zeigen, dass eine effiziente Sekretion mit der fragmentierten Golgi-Architektur vereinbar ist, von der in Säugetierzellen beobachteten stark verdichteten Bandstruktur bis hin zu den dispergierten Golgi-Ministapel kommen in Fliegen, Pflanzen und Hefe vor35,36,37. Darüber hinaus wurde die Sekretion durch Phosphorylierungsmutanten mit reduziertem Golgi-Targeting vollständig unterstützt, was darauf hindeutet, dass die Expression der Mutanten aus einem Plasmid unter dem CMV-Promotor ausreichend exogenes Protein produziert, um ihre reduzierte Assoziation mit Golgi-Membranen zu kompensieren.

Bei der Untersuchung von HeLa-Zellen, die mit einer Untergruppe von GBF1-Phosphorylierungsmutanten transfiziert waren, beobachteten wir einen auffälligen Anstieg der Zwei- und Mehrkernbildung im Vergleich zu Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimierten (Abb. 7a). Wir haben den Prozentsatz der Zellen quantifiziert, die zwei oder mehr Kerne enthalten, um zu zeigen, dass, während ~ 11,2 % der mit Wildtyp-GBF1 transfizierten Zellen eine Mehrkernbildung aufweisen, die Mehrkernbildung in Zellen, die spezifische Mutanten der Phosphorylierungsstelle exprimieren, dramatisch erhöht (> dreifach) ist (Abb . 7b). Insgesamt erhöhten 6 der 14 in dieser Studie getesteten Mutanten der Phosphorylierungsstelle die Mehrkernbildung. Interessanterweise weisen nicht-transfizierte Zellen eine geringere Multinukleationsrate auf (~ 2,9 %), was darauf hindeutet, dass selbst eine Überexpression von Wildtyp-GBF1 die Multinukleation erhöhte.

Die Expression spezifischer Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle führt zu einer Mehrkernbildung. HeLa-Zellen wurden mit Venus-markiertem Wildtyp-GBF1 oder der angegebenen Mutante der Phosphorylierungsstelle transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit Anti-GFP zum Nachweis transfizierter Zellen, mit Anti-GM130 zur Visualisierung der Golgi-Zellen und mit DAPI zur Beurteilung der Kernmorphologie gefärbt. (a) Repräsentative Bilder von Zellen, die Mutanten der Phosphorylierungsstelle exprimieren, die eine Mehrkernbildung verursachen. Beachten Sie den einzelnen Golgi, der an die zwei oder mehr Kerne in den transfizierten Zellen angrenzt. (b) Quantifizierung mehrkerniger Zellen basierend auf > 50 transfizierten Zellen, gezählt in 3 separaten Experimenten. Dargestellt ist der Prozentsatz der transfizierten Zellen mit zwei oder mehr Zellkernen. NT-Kontrolle: % der mehrkernigen, nicht transfizierten Zellen innerhalb desselben Objektträgers.

Wie in Abb. 7b gezeigt, verursachten Mutanten der Phosphorylierungsstelle mit Substitutionen an S233 oder Y515 eine Mehrkernbildung, unabhängig davon, ob die substituierende Aminosäure nicht phosphoryliert werden konnte (Änderung zu A oder C) oder ein Phospho-Mimetikum war (Änderung zu D oder E). . Dies deutet darauf hin, dass GBF1 möglicherweise an kritischen, aber unterschiedlichen mitotischen Ereignissen beteiligt ist, wenn es dephosphoryliert wird und wenn es an S233 und Y515 phosphoryliert wird. Im Gegensatz dazu verursachte GBF1 mit Substitutionen an S371 oder Y377 nur dann eine Mehrkernbildung, wenn diese Aminosäuren zu einem Phospho-Mimetikum mutiert waren, nicht jedoch, wenn die Phosphorylierung durch eine A-Substitution verhindert wurde. Dies legt nahe, dass die kontinuierliche Phosphorylierung dieser GBF1-Reste einen wichtigen mitotischen Prozess stört.

Um einen Einblick in den Prozess zu erhalten, der für die Multinukleation verantwortlich ist, haben wir das Fortschreiten der Mitose in Zellen überwacht, die mit jedem der sechs Multinukleation verursachenden Konstrukte transfiziert wurden. HeLa-Zellen, die GFP-markiertes GalT stabil exprimieren, wurden 24 Stunden lang mit Tomaten-markiertem Wildtyp-GBF1 oder einer Phosphorylierungsmutante transfiziert. Die Zellen wurden dann durch 30-stündige Behandlung mit RO-3306, einem CDK1-Inhibitor, synchronisiert, um den Zellzyklus bei G2/M anzuhalten. Anschließend wurden die Zellen in frisches Medium gegeben, um die mitotische Blockade aufzulösen, und man ließ sie 90 oder 120 Minuten lang die Mitose durchlaufen. Die Zellen wurden fixiert und mit Anti-RFP gefärbt, um transfizierte Zellen zu identifizieren, und mit Anti-acetyliertem Tubulin, um die Bildung zytokinetischer Brücken zu beurteilen. Repräsentative Bilder von Zellen, die Wildtyp-GBF1 oder die S371D-Phosphorylierungsmutante nach einer 90- bzw. 120-minütigen Freisetzung aus dem Mitoseblock exprimieren, sind in Abb. 8a bzw. b dargestellt.

Die Expression spezifischer Mutanten der GBF1-Phosphorylierungsstelle führt zu einer Verzögerung der Auflösung zytokinetischer Brücken. HeLa-Zellen, die GFP-markiertes GalT stabil exprimieren, wurden mit Tomato-markiertem Wildtyp-GBF1 oder jedem Multinukleation verursachenden Mutanten der Phosphorylierungsstelle transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 30 Stunden lang mit RO-3306 behandelt, um bei G2/M zum Stillstand zu kommen. Der mitotische Block wurde durch einen Wechsel auf frisches Medium gelöst und die Zellen wurden 90 oder 120 Minuten später fixiert. Die Zellen wurden mit Anti-RFP zum Nachweis transfizierter Zellen (rot), mit Anti-acetyliertem Tubulin zum Nachweis zytokinetischer Brücken (silber) und mit DAPI zum Nachweis der Zellkerne (blau) gefärbt. (a) Repräsentative Bilder von Zellen, die Wildtyp-GBF1 nach einer 90-minütigen und einer 120-minütigen Freisetzung aus dem G2/M-Block exprimieren, die zu einem späteren Zeitpunkt weniger zytokinetische Brücken zeigen. (b) Repräsentative Bilder von Zellen, die die S371D-Mutante nach einer 90-minütigen und einer 120-minütigen Freisetzung aus dem G2/M-Block exprimieren, die die Persistenz zytokinetischer Brücken zu einem späteren Zeitpunkt zeigen. (c) Bilder analog zu denen in (a) und (b) von 5 Zufallsfeldern (aus 3 Experimenten) für alle Mutanten der Phosphorylierungsstelle wurden verwendet, um die Anzahl der transfizierten Zellen zu zählen, die zytokinetische Brücken enthielten. Der Prozentsatz der transfizierten Zellen, die eine zytokinetische Brücke enthielten, wird angezeigt. Zur statistischen Analyse wurde der Prozentsatz der Zellen, die nach 90 Minuten eine Phosphorylierungsmutante mit einer zytokinetischen Brücke exprimierten, mit dem gleichen Wert für Zellen verglichen, die nach 90 Minuten Wildtyp-GBF1 exprimierten. In ähnlicher Weise wurde der Prozentsatz der Zellen, die nach 120 Minuten eine Phosphorylierungsmutante mit einer zytokinetischen Brücke exprimierten, mit dem gleichen Wert für Zellen verglichen, die nach 120 Minuten Wildtyp-GBF1 exprimierten. Vergleiche wurden mithilfe eines Student-t-Tests durchgeführt. P < 0,1 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***), P < 0,0001 (****).

Die Analyse analoger Bilder von Zellen, die Wildtyp-GBF1 oder Phosphorylierungsstellenmutanten exprimieren, die eine Mehrfachnukleation verursachen, zeigt, dass ~ 28 % der Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimieren, 90 Minuten nach der Freisetzung des mitotischen Blocks zytokinetische Brücken enthalten, und diese Zahl sinkt auf ~ 18 % 120 Minuten nach der Freisetzung, was den Abschluss der Zytokinese widerspiegelt (Abb. 8c). Im Gegensatz dazu enthalten Zellen, die die Multinukleation verursachenden Mutanten exprimieren, 90 Minuten nach der Freisetzung des mitotischen Blocks deutlich weniger zytokinetische Brücken als Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimieren, was auf eine mitotische Verzögerung hinweist. Darüber hinaus weisen Zellen, die Phosphorylierungsmutanten exprimieren, 120 Minuten nach der Freisetzung des Mitoseblocks eine signifikant erhöhte Anzahl zytokinetischer Brücken auf, was auf eine zusätzliche Verzögerung der Abszision der zytokinetischen Brücke schließen lässt (Abb. 8c).

Die statischen Immunfluoreszenzanalysen, die einen mitotischen Defekt in Zellen zeigten, die spezifische GBF1-Mutanten exprimierten, deuteten auf einen Defekt in der Zytokinese hin. Um die Zytokinese direkt zu visualisieren, analysierten wir die Zellteilung durch Zeitraffermikroskopie in lebenden Zellen. HeLa-Zellen, die stabil GFP-markiertes Tubulin exprimierten, wurden 24 Stunden lang mit Infrarot-Fluoreszenzprotein (iRFP)-markiertem Wildtyp-GBF1 oder der S233A-Phosphorylierungsmutante transfiziert. Die Zellen wurden dann durch 30-stündige Behandlung mit RO-3306 synchronisiert, um bei G2/M anzuhalten. Anschließend wurden die Zellen in frisches Medium gegeben, um die mitotische Blockade aufzulösen, und man ließ sie 60 Minuten lang die Mitose durchlaufen. Die Zellen wurden 30 Minuten lang mit 5 μM Biliverdin-Chromophor ergänzt, der als Cofaktor für iRFP fungiert, und dann 8 Stunden lang abgebildet. Wir beobachteten eine erfolgreiche zytokinetische Brückenabszision und Zellteilung in nicht transfizierten Zellen und in mit Wildtyp-GBF1 transfizierten Zellen (Abb. 9). Im Gegensatz dazu gelang es Zellen, die die S233A-Mutante exprimierten, nicht, die zytokinetische Brücke zu durchbrechen, und sie kollabierten zusammen, was zu einer mehrkernigen Zelle führte.

Die Expression einer Mutante der GBF1-Phosphorylierungsstelle führt zu einer Störung der Zytokinese. HeLa-Zellen, die GFP-markiertes Tubulin stabil exprimieren, wurden mit iRFP-markiertem Wildtyp-GBF1 oder der Mutante der S233A-Phosphorylierungsstelle transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 30 Stunden lang mit RO-3306 behandelt, um bei G2/M zum Stillstand zu kommen. Die mitotische Blockade wurde 60 Minuten lang gelöst, 5 μM Biliverdin wurden 30 Minuten lang zugegeben und die Zellen wurden dann 8 Stunden lang abgebildet. Repräsentative Bilder aus den Zeitraffervideos zeigen die erfolgreiche Zellteilung nicht transfizierter Kontrollzellen und von Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimieren. Zellen, die die S233A-Mutante exprimierten, konnten die zytokinetische Brücke nicht auflösen und verschmolzen zu einer zweikernigen Zelle.

Der Membranverkehr zwischen verschiedenen subzellulären Kompartimenten der sekretorischen und endozytischen Wege ist eine entscheidende Funktion aller eukaryotischen Zellen. Innerhalb des Sekretionswegs wird die Membran an der ER-Golgi-Grenzfläche durch COPII-Vesikel bewegt, die sich in anterograder Richtung bewegen, und durch COPI-Vesikel, die Schlüsselkomponenten in retrograder Richtung von Golgi nach ER recyceln. Die Bildung von COPI-Vesikeln erfordert die Aktivierung von Arf-GTPasen durch einen GDP/GTP-Austauschprozess, der durch den GBF1-Nukleotidaustauschfaktor katalysiert wird. Die katalytische Aktivität von GBF1 ist für die Aufrechterhaltung der COPI-Vesikelbildung, der Golgi-Homöostase und der Sekretion unbedingt erforderlich.

Die Aktivität vieler zellulärer Enzyme wird durch reversible Phosphorylierungen reguliert, und hier haben wir untersucht, ob Phosphorylierung die GBF1-Funktionalität beeinflusst. Wir haben zuvor bekannte GBF1-Phosphorylierungsstellen29 beschrieben und uns in dieser Studie nur auf Stellen innerhalb des N-Terminus von GBF1 konzentriert, die über GBF1-Orthologe hinweg konserviert sind. Sieben Stellen wurden entweder zu einem nicht phosphorylierbaren Rest oder zu einem Phospho-Mimetikum mutiert, und die Funktionen der resultierenden Mutanten wurden in einer Reihe zellulärer Tests mit denen von Wildtyp-GBF1 verglichen. Wir haben herausgefunden, dass die meisten (10 von 14) Phosphorylierungsmutanten (sowohl die nicht phosphorylierbaren als auch die phosphomimetischen) eine verringerte Effizienz beim Targeting auf den Golgi aufwiesen. Da sich der Großteil der analysierten Phosphorylierungsstellen innerhalb weitgehend unstrukturierter Schleifen innerhalb des N-Terminus von GBF1 befindet, kann postuliert werden, dass diese Regionen eine Rolle bei den Wechselwirkungen (entweder intramolekular oder mit anderen Proteinen/Lipiden) spielen, die die Bindung an die Golgi-Membran erleichtern.

Wir haben die Funktionalität der GBF1-Phosphorylierungsmutanten anhand einer Reihe von Kriterien bewertet. Zunächst untersuchten wir, ob die Mutanten die Golgi-Homöostase unterstützen könnten, wenn das endogene GBF1 mit BFA inaktiviert wurde (alle unsere Mutanten sind durch die A795E-Substitution so konstruiert, dass sie BFA-resistent sind). Wir haben herausgefunden, dass die Mutation von S174 zu A oder D seine Fähigkeit, die Golgi-Architektur zu unterstützen, hemmt, was dazu führt, dass fragmentierte Golgi-Elemente immer noch in der perinuklearen Region geclustert sind (Abb. 3c und Tabelle 1). S174 befindet sich innerhalb der DCB-Domäne, die die GBF1-Dimerisierung erleichtert. Da die Dimerisierung jedoch für die GBF1-Funktion nicht erforderlich zu sein scheint38, ist es möglich, dass die Mutation von S174 die GBF1-Funktionalität durch einen bestimmten Mechanismus beeinflusst, möglicherweise durch Verringerung der Fähigkeit des Mutanten, sich daran zu beteiligen produktive Wechselwirkungen auf der Membran. Diese Idee steht im Einklang mit der Tatsache, dass die S174A/D-Mutanten nicht dominant negativ wirken, was darauf hindeutet, dass sie nicht effizient mit dem endogenen GBF1 in Zellen konkurrieren. Ein geringfügiger Anstieg der Golgi-Fragmentierung wurde auch in Zellen beobachtet, die den Y515C-Mutanten exprimierten, und ist höchstwahrscheinlich auf die verringerte Fähigkeit dieses Mutanten zurückzuführen, auf den Golgi-Gen zu zielen. Alle anderen Phosphorylierungsmutanten konnten die Golgi-Homöostase unterstützen, wenn das endogene GBF1 mit BFA inaktiviert wurde, was darauf hindeutet, dass alle diese Mutanten funktionsfähig sind.

Zweitens fragten wir, ob die Mutanten in Gegenwart von endogenem GBF1 dominant negativ wirken könnten, da funktionell beeinträchtigte GBF1-Mutanten mit Mutationen in der katalytischen Sec7-Domäne (die E794K- und die 7A-Mutanten) die Golgi-Homöostase und -Sekretion stören, wenn sie in Zellen exprimiert werden7 ,34. In Zellen, die S233A, S233D, S352A und Y515E exprimierten, wurde eine minimale Störung der Golgi-Architektur beobachtet, aber insgesamt hatte keiner der Phosphorylierungsmutanten einen signifikanten Einfluss auf die Golgi-Homöostase, was darauf hindeutet, dass alle Mutanten ausreichend funktionsfähig sind, um diese Aktivität zu unterstützen.

Drittens testeten wir die Fähigkeit der GBF1-Phosphorylierungsmutanten, einen operativen Sekretionsweg aufrechtzuerhalten. Alle Mutanten waren vollständig in der Lage, die Sekretion eines löslichen Fragments der Gaussia-Luciferase zu erleichtern, das ein Signalpeptid enthielt, das es ihm ermöglicht, in den Sekretionsweg einzutreten39 (Tabelle 1). Es bleibt möglich, dass die Kinetik des Transports spezifischer löslicher Ladungen oder des Transports von Transmembranproteinen in Zellen verändert wird, die die GBF1-Phosphorylierungsmutanten exprimieren und in denen endogenes GBF1 mit BFA inaktiviert wird. Die Fähigkeit der Mutanten, die Sekretion zu unterstützen, obwohl einige von ihnen (S174A/D und Y515C) nicht in der Lage sind, die intakte Golgi-Architektur aufrechtzuerhalten, steht im Einklang mit der Fähigkeit fragmentierter Golgi-Elemente, die Sekretion weiterhin zu unterstützen35,36,37.

Während unserer Analysen beobachteten wir, dass Zellen, die einige der GBF1-Phosphorylierungsmutanten exprimierten, häufig zwei- oder mehrkernig waren. Um dieses Phänomen zu untersuchen, analysierten wir die Keimbildung in Zellen, die die Mutanten exprimierten, 48 Stunden lang, was etwa zwei Verdopplungszeiten für HeLa-Zellen entspricht40,41,42. Die höchste Induktion der Multinukleation (mehr als das Zehnfache gegenüber der in nicht transfizierten Kontrollzellen beobachteten) wurde in Zellen beobachtet, die die Mutanten S233A, S233D, S371D, Y377E, Y515C und Y515E exprimierten (Tabelle 1). Die mehrkernigen Zellen enthielten eine einzige morphologisch erkennbare Golgi-Struktur, die an die Kerne angrenzte, was mit unseren Analysen der normalen Golgi-Morphologie und Sekretionsphänotypen in Zellen übereinstimmt, die diese Mutanten exprimieren.

Ein Multinukleationsphänotyp spiegelt häufig Defekte während der Mitose und insbesondere Komplikationen während der Zytokinese wider. Mehrkernige Zellen können häufig die Mitose bis zur Telophase durchlaufen, sind jedoch nicht in der Lage, die zytokinetische Brücke zu bilden oder zu durchtrennen, was zum Zusammenbruch der Tochterzellen zu einer einzigen Einheit mit zwei duplizierten Kernen führt. Wir analysierten die Bildung und Auflösung der zytokinetischen Brücken in Zellen, die die 6 Multinukleations-verursachenden GBF1-Phosphorylierungsmutanten exprimieren. Die Zellen wurden im G2/M-Stadium der Mitose synchronisiert und blockiert und dann für 90 oder 120 Minuten freigesetzt, damit sie sich erholen und die letzten Schritte der Mitose durchlaufen konnten. Zellen, die die GBF1-Phosphorylierungsmutanten exprimieren, schienen zytokinetische Brücken später zu bilden als Zellen, die den Wildtyp-GBF1 exprimieren, was darauf hindeutet, dass sie die Mitose möglicherweise langsamer durchlaufen. Darüber hinaus beobachteten wir eine signifikante Hemmung des Fortschreitens der Zytokinese in diesen Zellen, wobei ein höherer Prozentsatz der Zellen noch zytokinetische Brücken enthielt, zu einem Zeitpunkt, als diese in Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimierten, weitgehend aufgelöst waren.

Die Bildgebung der Zellteilung mittels Zeitraffermikroskopie bestätigte einen zytokinetischen Defekt in Zellen, die mit der Multinukleationsmutante S233A transfiziert waren. Während nicht-transfizierte Zellen und Zellen, die Wildtyp-GBF1 exprimieren, zytokinetische Brücken zwischen den Tochterzellen bildeten und diese Brücken anschließend gebrochen wurden, was die Trennung der Zellen ermöglichte, erzeugten Zellen, die die S233A-Mutante exprimierten, eine zytokinetische Brücke, die jedoch anschließend zusammenbrach und die Tochterzelle verursachte Zellen verschmelzen zu einer einzigen, mehrkernigen Zelle. Es wurde zuvor beschrieben, dass die kleine GTPase Rab1 eine Rolle bei der Zytokinese in Drosophila43 spielt, indem sie die Konstriktion des kontraktilen Rings steuert. In mehreren Studien wurde gezeigt, dass Rab1 mit GBF1 interagiert44,45,46 und möglicherweise ist diese Interaktion bei unseren GBF1-Phosphorylierungsmutanten gestört. Zukünftige Studien werden erforderlich sein, um diese Möglichkeit zu untersuchen.

Über eine Hemmung der Zytokinese wurde bereits in Zellen berichtet, die eine nicht phosphorylierbare Mutante von GBF1 (S292A/S297A) exprimieren, die GBF1 stabilisiert und seinen Abbau verhindert26. Unsere umfassenden Studien identifizierten zusätzliche Phosphorylierungsstellen innerhalb von GBF1, die bei Mutation zu einem Phospho-Mimetikum (die Mutanten S233D, S371D, Y377E und Y515E) Defekte in der Zytokinese verursachen. Wir dokumentieren jedoch auch, dass GBF1-Mutanten, die nicht phosphoryliert werden können (die S233A- und Y515C-Mutanten), Probleme bei der Zytokinese verursachen können. Wir betonen, dass alle diese Mutanten die Zytokinese in Gegenwart von funktionellem endogenem GBF1 dominant negativ hemmen.

Eine frühere Studie zeigte, dass die Expression der nicht phosphorylierbaren S292A/S297A-Mutante die Koaleszenz der Golgi-Fragmente während der Mitose verringerte und die Zytokinese stoppte26. Es scheint, dass unsere Mutanten, die eine Multinukleation verursachen, möglicherweise auch die Dynamik von Golgi-Elementen beeinflussen und dass dies die Ursache für die Störung der Abszision der zytokinetischen Brücke sein könnte. Wir verfolgten die Motilität von GalT-haltigen Golgi-Elementen in Zellen, die die Mutanten mit mehreren Kernen exprimieren, die GBF1-Phosphorylierung verursachen, im Laufe der Zeit und zeigten eine allgemeine Verringerung der Golgi-Dynamik in Zellen, die die Mutanten S233A, S371D, Y377E und entweder Y515C oder Y515E exprimieren (Tabelle 1). ). Während die molekulare Grundlage der verminderten Motilität noch geklärt werden muss, ist es möglich, dass die Phosphorylierungsmutanten die Fähigkeit von Golgi-Fragmenten verändern, sich an Mikrotubuli-Motoren zu koppeln, und dadurch ihren Transport zum Mikrotubuli-Organisationszentrum beeinträchtigen. In mitotischen Zellen würde ein solcher Motilitätsdefekt die Verschmelzung von Golgi-Fragmenten zu einer einzigen Golgi-Struktur am Zentrosom verhindern.

Der in unseren Studien beobachtete zytokinetische Defekt unterscheidet sich vom gut beschriebenen Golgi-Demontage-Kontrollpunkt, bei dem die Mitose abgebrochen wird, wenn das Golgi-Band nicht fragmentiert ist47,48. Normalerweise zerfällt das Golgi-Band während der Mitose in einem mehrstufigen Prozess, der die anfängliche Trennung der röhrenförmigen Kontinuitäten zwischen den Stapeln während G2 umfasst, gefolgt von der Entstapelung der Zisterne und der Bläschenbildung der nicht verbundenen Zisterne in der Metaphase. In der Anaphase reformiert sich der Golgi und erscheint zunächst an zwei Stellen wieder als kleiner Golgi in der Nähe der zytokinetischen Brücke und als größerer Golgi am gegenüberliegenden Pol in der Nähe des Zentrosoms. In der späten Anaphase wandert der kleinere Golgi zum Zentrosom und verschmilzt mit dem größeren Golgi, um eine einzige Organelle zu bilden49.

Der anfängliche Golgi-Abbau wird durch eine Vielzahl von Kinasen vorangetrieben, darunter MEK1, CDK1 und Plk1, die auf Golgi- und GRASP-Proteine ​​abzielen, um den Golgi-Abbau voranzutreiben50. Behandlungen, die die Golgi-Fragmentierung verhindern, wie die Injektion von Anti-GRASP65-Antikörpern oder die Expression nicht phosphorylierbarer Mutanten von GRASP65, die die Golgi-Stapelung in Interphasenzellen verbessern, verhindern, dass die Zellen nach Abschluss der S-Phase in die Mitose eintreten51,52. In ähnlicher Weise verhindert die Expression der konstitutiv aktiven Arf1 (Q71L)-Mutante die mitotische Golgi-Zerlegung und blockiert das Eindringen von Zytokinesefurchen53. Darüber hinaus führt die Konstruktion einer physikalischen Barriere gegen die Golgi-Fragmentierung durch Beladung des Golgi-Lumens mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-Polymeren auch dazu, dass Zellen in der Metaphase mit zirkulären DNA-Profilen und monopolaren Spindeln arretieren. In diesen Zellen gelingt es den Zentrosomen nicht, sich zu trennen, wodurch eine normale Spindelbildung verhindert wird54.

Die Notwendigkeit einer Golgi-Zerlegung im mitotischen Verlauf wird auch durch Studien mit GBF1-Mutanten unterstrichen. GBF1 wird während der Mitose durch AMPK an Threonin 1337 (T1337) phosphoryliert. Diese Modifikation ist für die Dissoziation von GBF1 von Golgi-Membranen und die anschließende Fragmentierung des Golgi und den Eintritt von Zellen in die Mitose erforderlich25. Die Expression der nicht phosphorylierbaren T1337A-Mutante verhindert die Golgi-Fragmentierung und verhindert auch den Eintritt in die Mitose am G2/M-Kontrollpunkt und korreliert mit der Hemmung der Chromatinkondensation, dem Fehlen der Histon-3-Phosphorylierung und einer Abnahme der Anzahl abgerundeter Zellen25.

Hierin dokumentieren wir eine neuartige Funktion von GBF1 bei der Kontrolle später Stadien der Mitose, insbesondere der für die Zytokinese erforderlichen Ereignisse, und zeigen, dass diese Funktion durch ortsspezifische Phosphorylierung reguliert wird. Im Gegensatz zum zuvor beschriebenen frühen mitotischen Stillstand (vor oder in der Metaphase) hemmen unsere GBF1-Phosphorylierungsmutanten nicht die Golgi-Zerlegung, sondern den späteren Zytokineseschritt. Unsere Ergebnisse deuten auf die Existenz eines Kontrollpunkts für den mitotischen Golgi-Zusammenbau hin, der die Abszision der zytokinetischen Brücke verhindert, wenn die Zelle auf Probleme beim Golgi-Zusammenbau stößt. Es könnte auch relevant sein, dass der Abschluss der Zytokinese den Umbau der Plasmamembran innerhalb der zytokinetischen Brücke erfordert, wobei Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) eine wichtige Rolle spielt55. Interessanterweise wurde gezeigt, dass GBF1 bevorzugt an PIP256 bindet, was möglicherweise auf eine vorübergehende Lokalisierung und/oder Funktion an der zytokinetischen Brücke hinweist. Zukünftige Studien müssen die molekularen Mechanismen untersuchen, durch die bestimmte GBF1-Phosphorylierungsmutanten eine zytokinetische Hemmung verursachen.

GBF1/A795E wurde bereits zuvor beschrieben57. Das Plasmid pVenus-GBF1 A795E war ein Geschenk von Dr. George Belov (University of Maryland, College Park, MD). Das ptdTomato-N1-Plasmid wurde von Takara Bio (Mountain View, CA) erworben. Das iRFP-713-Plasmid war ein Geschenk von Dr. Alexa Mattheyses (University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL). GBF1/A795E wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und EcoRI in das Tomatenplasmid ligiert. GBF1/A795E wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und SacII in das iRFP-Plasmid ligiert. Punktmutationen wurden in die GBF1/A795E-Venus-, Tomato- und iRFP-Konstrukte mithilfe des QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit eingeführt, das von Agilent Technology (Santa Clara, CA) erworben wurde. Alle Substitutionen wurden durch Sequenzierung bestätigt.

HeLa-Zellen (ATCC, Manassas, VA), HeLa-Zellen stabil transfiziert mit GFP-markierter Beta-1,4-Galactosyltransferase (GalT) (Geschenk von Dr. Jack Rohrer, Zürcher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, Wädenswil, Schweiz) und HeLa-Zellen stabil transfiziert mit GFP-markiertem Tubulin (Geschenk von Dr. Ryoma Ohi, University of Michigan, Ann Arbor, MI) wurden in MEM-Medium (Thermo Scientific, Waltham, MA) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1 % Natriumpyruvat, 1 % Natriumbicarbonat, 1 % PenStrep und 0,2 % NEAA. Die Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. Die Zelltransfektion wurde mit TransIT-LT1-Transfektionsreagenz (Mirus Bio, Madison, WI) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.

In einigen Experimenten wurden die Zellen vor der Verarbeitung 1 Stunde lang mit 0,5 % BFA (erworben von Cell Signaling Technology, Beverly, MA) inkubiert. Die Zellen wurden wie folgt für die Immunfluoreszenz verarbeitet: Die Zellen wurden dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, 10 Minuten lang in 3% Paraformaldehyd in PBS fixiert und 10 Minuten lang mit 10 mM Ammoniumchlorid in PBS gequencht. Die Zellen wurden 7 Minuten lang in 0,1 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Die Zellen wurden erneut mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden jeweils 5 Minuten lang mit 0,4 % Fischhautgelatine in PBS und 2,5 % Ziegenserum in PBS blockiert. Die Zellen wurden mit primären Antikörpern, verdünnt in 0,4 % Fischhautgelatine, 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS, das 0,2 % Tween-20 (PBST) enthielt, gewaschen und wie oben beschrieben blockiert. Die Zellen wurden mit sekundären Antikörpern, verdünnt in 2,5 % Ziegenserum, 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kerne wurden 3 Minuten lang mit DAPI gefärbt und die Zellen wurden mit PBST gewaschen. Die Zellen wurden mit ProLong Glass Antifade-Eindeckmittel (Thermo Scientific, Waltham, MA) auf Objektträgern montiert.

Transfizierte HeLa-Zellen wurden in RIPA-Puffer (150 mM Natriumchlorid, 1 % NP-40, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris pH 8 und 1 mM EDTA), ergänzt mit einem Proteaseinhibitor-Cocktail, lysiert. Das Homogenat wurde 10 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 U/min in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Zelllysate wurden in 8 % Acrylamidgelen aufgetrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Trockenmilch, verdünnt in 0,1 % PBST, blockiert. Die Membranen wurden mit in Milch/PBST verdünnten Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Membranen wurden mit in Milch/PBST verdünnten Sekundärantikörpern 45 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden dreimal mit PBST und dreimal mit PBS gewaschen. Zur Visualisierung wurden die Membranen mit einem verbesserten Chemilumineszenz-Kit inkubiert. Kaninchen-Anti-GFP- und Maus-Anti-GAPDH-Primärantikörper wurden in einer Konzentration von 1:1000 verwendet. Anti-Kaninchen- und Maus-HRP-konjugierte Sekundärantikörper wurden in einer Konzentration von 1:5000 verwendet.

Monoklonaler Maus-Anti-GAPDH (ab8245) und polyklonaler Kaninchen-Anti-GFP (ab290) wurden von Abcam (Cambridge, MA) erworben. Der monoklonale Maus-Anti-GM130 (610823) wurde von BD Bioscience (San Jose, CA) erworben. Polyklonaler Kaninchen-Anti-RFP (600-401-379) und polyklonaler Kaninchen-Anti-GFP (600-401-215) wurden von Rockland (Philadelphia, PA) gekauft. Monoklonales antiacetyliertes Tubulin der Maus (T6793) wurde von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) gekauft. Sekundäre Ziegen-Anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit Alexa 594 (A32742), Alexa 647 (A21235) und Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit Alexa 488 (A32731) und Alexa 594 (A32740), wurden von Thermo Scientific (Waltham, MA) erworben. An HRP konjugierte sekundäre Ziegen-Anti-Maus- und Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper wurden von SouthernBiotech (Birmingham, AL) gekauft.

HeLa-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit Plasmiden, die Gaussia-Luciferase (GLuc) und die GBF1-Mutanten kodieren, cotransfiziert. Als Negativkontrolle wurde ein leerer Vektor verwendet. Am nächsten Tag wurde das Medium entfernt und die Zellen wurden gewaschen, um sekretierte Luciferase zu entfernen, und in 25 μl frischem Medium, ergänzt mit der angegebenen Menge BFA, inkubiert. Nach 4-stündiger Inkubation wurde das Medium in eine andere 96-Well-Platte überführt und die Menge an sekretierter Luciferase mit einem BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit (New England BioLabs, Ipswich, MA) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen.

HeLa-Zellen wurden mit 10 μM des CDK1-Inhibitors RO-3306 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) behandelt, um Zellen in G2 zu synchronisieren. Die Zellen wurden 30 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 in einen Inkubator gestellt. Die Zellen wurden dreimal mit vorgewärmtem PBS gewaschen, um die Zellen aus dem G2-Block zu lösen. Die Zellen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit frischem Kulturmedium inkubiert, damit der Zellzyklus fortschreiten konnte.

Zellbilder wurden mit einem Leitz-Wetzlar-Mikroskop Typ 307, ausgestattet mit einer 12-Bit-CCD-Kamera, und einem Nikon Eclipse Ti2-Mikroskop aufgenommen. Fluoreszenzkanäle wurden mit der ImageJ-Software zusammengeführt. Zeitrafferaufnahmen wurden mit HeLa-Zellen, die GFP-markiertes GalT stabil exprimierten, und HeLa-Zellen, die GFP-Tubulin stabil exprimierten, auf einem Olympus FluoView1000 unter Verwendung eines 20x/0,95 NA-Wasserobjektivs durchgeführt. Z-Stapel-Schnitte wurden für das Objektiv mit einer Dicke von 1,18 mm optimiert. Für die Dauer der Bildgebung befanden sich die Zellen auf einer 37 °C heißen Heizplatte und wurden in L-15-Medium (Thermo Scientific, Waltham, MA), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, gehalten. Mit iRFP-markierten Plasmiden transfizierte Zellen wurden vor der Bildgebung 30 Minuten lang mit 5 μM Biliverdin (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) inkubiert.

Wie oben beschrieben aufgenommene Immunfluoreszenzbilder wurden mit ImageJ geöffnet. Kanäle wurden mit der Funktion „Kanäle teilen“ aufgeteilt. Golgi befand sich im roten GM130-Kanal und die GFP-Pixelintensität wurde an dieser Stelle im grünen GFP-Kanal mithilfe der Freihandauswahl- und Messfunktionen gemessen. Die GFP-Pixelintensität der gesamten Zelle wurde mit denselben Freihandauswahl- und Messfunktionen gemessen. Anschließend wurde das Verhältnis der GFP-Pixelintensität am Golgi berechnet.

Immunfluoreszenzbilder wurden mit MATLAB geöffnet. Die Hintergrundfluoreszenz wurde eliminiert, indem die Bilder mit einem Otsu-Algorithmus zur Schwellenwertbildung ausgeführt wurden. Das grüne Fluoreszenzsignal, das auf transfizierte Zellen hinweist, wurde mithilfe einer Kombination von Maskierungsfiltern für den grünen Kanal extrahiert. Das rote Fluoreszenzsignal, das auf Golgi-Partikel hinweist, wurde mithilfe einer Kombination von Maskierungsfiltern für den roten Kanal extrahiert. Die Kanäle wurden kombiniert und die im grünen Kanal enthaltenen roten Pixel wurden gemessen und nach Größe und Häufigkeit in einem Verteilungsdiagramm dargestellt.

Live-Cell-Imaging-Filmdateien der HeLa-GalT-Zellen wurden mit Fiji-Software geöffnet und zu einem einzigen Zeitverlaufsstapel kombiniert und aufgeteilt, um die GFP-Emission zu extrahieren. Der Hintergrund wurde gemessen und die Bleichkorrektur wurde mit der einfachen Verhältnismethode durchgeführt. Anschließend wurde der Bildstapel mithilfe des MultiStackReg- und des Rigid-Body-Ansatzes registriert, um die Drift während der Bildgebung zu korrigieren. Das zeitliche Farbcode-Plugin wurde mit einer Jet-Nachschlagetabelle verwendet, um die Golgi-Fragmente basierend auf der Bewegung zu kennzeichnen.

Die Prozentsätze des GBF1-Golgi-Targetings, der mehrkernigen Zellen und der Zellen mit zytokinetischen Brücken wurden mit der Prism-Software berechnet. Datensätze wurden mit dem Student-t-Test verglichen.

Alle in dieser Studie gewonnenen Daten sind auf schriftliche Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Wir möchten uns bei der High Resolution Imaging Facility (NIH P30 AR048311) der UAB bedanken. Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium R01GM122802 an ES und das National Science Foundation-Stipendium MCB-1615607 an ES unterstützt.

Die Forschung wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01GM122802 und T90DE022736) unterstützt.

Abteilung für Zell-, Entwicklungs- und Integrative Biologie, University of Alabama in Birmingham, 1918 University Boulevard, MCLM 668, Birmingham, AL, 35233-2008, USA

Kendall Walton, Tomasz J. Nawara, Allyson R. Angermeier, Hadley Rosengrant, Eunjoo Lee, Bridge Wynn und Elizabeth Sztul

Abteilung für Veterinärmedizin, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, University of Maryland, College Park, MD, 20742, USA

Ekaterina Victorova und George Belov

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KW führte Experimente durch, erstellte Abbildungen und redigierte das Manuskript; TJN führte Experimente durch, erstellte Abbildungen und redigierte das Manuskript; ARA führte Experimente durch, erstellte Abbildungen und redigierte das Manuskript; HR führte Experimente durch, erstellte Abbildungen und redigierte das Manuskript; EL führte Experimente durch und leitete das experimentelle Design; BW führte Experimente durch und redigierte das Manuskript; EV führte Experimente durch, erstellte Abbildungen und redigierte das Manuskript; GB leitete das experimentelle Design und redigierte das Manuskript; und ES leitete das experimentelle Design, interpretierte die Ergebnisse und schrieb das Manuskript.

Korrespondenz mit Kendall Walton.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Walton, K., Nawara, TJ, Angermeier, AR et al. Ortsspezifische Phosphorylierungen des Arf-Aktivators GBF1 regulieren die GBF1-Funktion bei der Golgi-Homöostase und -Sekretion im Vergleich zur Zytokinese unterschiedlich. Sci Rep 13, 13609 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-40705-5

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Eingegangen: 13. Oktober 2022

Angenommen: 16. August 2023

Veröffentlicht: 21. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-40705-5

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