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May 24, 2024

Auswirkungen endophytischer Pilze auf den parasitären Prozess von Taxillus chinensis

Scientific Reports Band 12, Artikelnummer: 7744 (2022) Diesen Artikel zitieren 1514 Zugriffe 1 Zitate 1 Altmetrische Metrikdetails Taxillus chinensis (DC.) Danser ist ein weit verbreiteter Heilstrauch

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7744 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Taxillus chinensis (DC.) Danser ist ein häufig verwendeter Heilstrauch in der traditionellen und modernen Medizin. Es handelt sich um eine mehrjährige halbparasitäre Pflanze, deren künstliche Vermehrung aufgrund ihrer geringen Parasitenrate schwierig ist. Ein erfolgreicher Parasitismus parasitärer Pflanzen besteht darin, ihr Gewebe zu verschmelzen und ihr Gefäßsystem mit dem Gefäßsystem des Wirts zu verbinden, wodurch eine physiologische Brücke entsteht, die ihren Wirtspflanzen effizient Wasser, Zucker und Nährstoffe entziehen kann. Es wird berichtet, dass endophytische Pilze eine wichtige Rolle beim Abbau und der Fusion von Zellwänden spielen, was den Schlüsselbildungsprozess der physiologischen Brücke darstellt. Daher wurden in dieser Studie die endophytischen Pilze von T. chinensis verschiedener Wirte isoliert und anschließend die Organismen, die die Hauptbestandteile der Zellwände abbauen konnten, mithilfe eines Mediums herausgesucht, das aus Guaihuol und Zelluloseabbaukapazität bestand. Die Ergebnisse zeigten, dass fünf Stämme aus 72 endophytischen Pilzen von T. chinensis herausgesucht wurden, die über hohe Enzymaktivitäten für den Lignozelluloseabbau verfügen. Die Laccase- und Cellulase-Aktivitäten von fünf Stämmen erreichten ihren Höhepunkt am Tag 7, und die höchsten Enzymaktivitäten dieser beiden Enzyme wurden bei Stamm P6 gefunden, die bei 117,66 bzw. 1,66 U/ml lag. Manganperoxidase von Stamm 4 und Ligninperoxidase von Stamm N6 erreichten ebenfalls ihren Höhepunkt am 7. Tag und waren mit Enzymaktivitäten von 11,61 bzw. 6,64 U/ml die höchsten unter den 5 Stämmen. Die Stämme 4, 15, 31, N6 und P6 wurden anhand ihrer morphologischen und molekularbiologischen Eigenschaften als Colletotrichum sp., Nigerrospora sphaerica, Exserohilum sp., Diaporthe Phaseolorum und Pestalotiopsis sp. identifiziert. Die endophytischen Pilze können wirksame Enzyme zum Zellwandabbau absondern, die die Auflösung und Entspannung der Zellwand zwischen T. chinensis und Wirt fördern und so zum Parasitismus von T. chinensis beitragen.

Taxillus chinensis (DC.) Danser gehört zur Familie der Loranthaceae und ist hauptsächlich in den südlichen und südwestlichen Gebieten Chinas verbreitet. Die trockenen Stängel und Zweige mit Blättern von T. chinensis sind häufig verwendete Zutaten in der traditionellen chinesischen Medizin und werden in China „Sang Ji Sheng“ genannt. T. chinensis hat einen hohen medizinischen Wert. Es wird zur Linderung rheumatischer Erkrankungen, zur Stärkung von Leber und Nieren, zur Stärkung von Sehnen und Knochen und zur Vorbeugung von Fehlgeburten eingesetzt1. T. chinensis ist eine hemiparasitische Pflanze mit vielfältigen Wirten2. Mittlerweile wird T. chinensis auch als Rohstoff für die Herstellung von Parasitismus-Tee in China verwendet, einem traditionellen chinesischen Lebensmitteltee für die Gesundheitsfürsorge, der in fast 30 Länder in Südostasien exportiert wird3. Daher steigt die Nachfrage nach T. chinensis aufgrund seines immensen therapeutischen Potenzials auf dem globalen Kräutermarkt ständig. Allerdings stammt T. chinensis hauptsächlich aus Wildbeständen, die die steigende Nachfrage des Marktes nicht vollständig decken können. Die künstliche Kultivierung von T. chinensis ist eine wirksame Maßnahme, um Angebot und Nachfrage auf dem Markt auszugleichen.

Allerdings handelt es sich bei T. chinensis um eine mehrjährige halbparasitäre Pflanze, die sich aufgrund ihrer geringen Parasitenrate nur schwer künstlich vermehren lässt. Ein wesentlicher Bestandteil des parasitären Erfolgs bei parasitären Pflanzen ist die Fähigkeit, die Zellwände ihres Wirts zu verschmelzen und ihr Gefäßsystem durch ein spezielles Organ namens Haustorium zu verbinden und so eine physiologische Brücke zu bilden4,5,6,7. Dies ermöglicht die Übertragung nicht nur von Wasser und Nährstoffen in den Parasiten, sondern auch von Makromolekülen, einschließlich mRNAs8 und Proteinen9. Somit ist die Zellwand des Wirts die erste Barriere für die Bildung einer physiologischen Brücke. Interessanterweise haben Studien ergeben, dass das Eindringen in das Haustorium keine nennenswerten Schäden an den Zellen der Wirtspflanze verursacht. Beispielsweise verursacht das Haustorium von Striga hermonthica beim Eindringen keine Schädigung der Endodermiszellen der Wirtspflanze10,11,12. Dies kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden. In den meisten parasitären Pflanzen der Familie Orobanchaceae wurde im parasitären Prozess eine große Anzahl von Enzymen gefunden, die mit dem Zellwandabbau in Zusammenhang stehen12,13. An den Einstichstellen des Hastoriums von Oroanche cumana Wallr findet sich beispielsweise Pektinmethylesterase, die Pektin abbauen kann. und Phelipanche aegyptiaca Pers.14. Es wurde gezeigt, dass andere Zellwandmodifikatoren wie Dilatasen und Enzyme mit Transglucanase-Aktivität während der Penetrationsperiode einer Dodder-Infektion von WM-Xylglucan ihren Höhepunkt erreichen. Im Gegensatz dazu verringerte die Hemmung dieser WM-Xylglucan-Modifikatoren die Chance einer erfolgreichen Dodder-Invasion15. Daher spielen Enzyme, die mit dem Zellwandabbau in Zusammenhang stehen, während des Parasitenprozesses eine wichtige Rolle. Der Ursprung dieser Enzyme wurde jedoch nicht weiter erforscht.

T. chinensis ist eine hemiparasitische Pflanze mit verschiedenen Wirten2. Unsere früheren Arbeiten ergaben, dass T. chinensis aus verschiedenen Wirten über reichhaltige endophytische Pilzressourcen verfügte. Es wurde berichtet, dass endophytische Pilze eine wichtige Rolle bei Infektions- und Kolonisierungsstrategien von Wirtspflanzen spielen. Viele Studien haben auch gezeigt, dass endophytische Pilze eine starke Fähigkeit zur Produktion von Enzymen haben, die mit dem Zellwandabbau in Zusammenhang stehen16,17. Zu den endophytischen Pilzen, von denen berichtet wurde, dass sie Xylanase produzieren, gehören beispielsweise Alternaria alternata18, Hymenoscyphus ericae19 und Aspergillus terreus20. De Almeida et al.21 wählten Stämme der Endophytenart Acremonium für die Produktion von Hemicellulasen und Cellulasen aus. Suto et al.22 isolierten 155 Pilzstämme, die Xylanasen produzierten. Harnpicharnchai et al.23 reinigten eine thermotolerante β-Glucosidase aus einer endophytischen Periconia sp. aus 14 Pflanzenarten. Robl et al.16 isolierten 110 endophytische Pilzstämme, die Hemicellulasen und verwandte Enzyme produzierten. Andere Studien befassten sich mit der Auswahl neuer Isolate unter Verwendung extrazellulärer Enzyme als Auswahlparameter zur Förderung des Pflanzenwachstums. So untersuchten Silva et al.24 aus Annona spp. isolierte Pilze, während Luz et al.25 Isolate aus Passiflora edulis verwendeten. Die Studie von Queiroz et al.26 ergab, dass in Bezug auf die CAZyme in den Sekretomen der analysierten Pilze die am häufigsten vorkommenden CAZym-Familien Glycosylhydrolase und Serinproteasen waren. Und diese Studie zeigt, dass Sekretome von endophytischen und nicht-endophytischen Pilzen ein gemeinsames Arsenal an Proteinen aufweisen, die für den Infektions- und Kolonisierungsprozess von Wirtspflanzen wichtig sind. Darüber hinaus führten Jaklitsch et al.27 eine phylogenetische Analyse der pflanzlichen Zellwand abbauenden kohlenhydrataktiven Enzyme und Hilfsproteine ​​durch, die in den Genomen von neun Trichoderma-Arten kodiert sind, die zu drei großen infragenerischen Gruppen sowie zwölf weiteren Hypocreales-Pilzen gehören. Druzhinina et al.28 untersuchten die Entwicklung von Proteinen, die für den Abbau pflanzlicher Zellwände in neun Trichoderma-Genomen erforderlich sind, und fanden eine beispiellose Anzahl von lateralen Gentransferereignissen (LGT) für Gene, die diese Enzyme kodieren.

Es ist bekannt, dass die Hauptbestandteile pflanzlicher Zellwände Lignin und Zellulose sind. Über die Rolle von Pilzen beim Abbau dieser Substanzen wurde ausführlich berichtet, diese Berichte konzentrierten sich jedoch hauptsächlich auf einige Arten holzverrottender Pilze, wie den Weißfäulepilz Phanerochaete chrysosporium Burds und Ceriporiopsis subvermispora (Pila T) Gilb. & Ryvarden und der Braunfäulepilz Postia placenta (Fr.) MJ Larsen & Lombard usw.29,30,31. Weißfäulepilze gelten als die wirksamsten und sind die wichtigsten Mikroorganismen für den Ligninabbau. Weißfäulepilze haben im langfristigen biologischen Evolutionsprozess ein einzigartiges Abbausystem gebildet. Laccase, Manganperoxidase und Ligninperoxidase bilden gemeinsam das Ligninabbau-Enzymsystem von Weißfäulepilzen32 und können alle Bestandteile pflanzlicher Zellwände, einschließlich Lignin, Cellulose und Hemicellulosen, abbauen33,34.

Derzeit ist wenig über den Mechanismus endophytischer Pilze beim Abbau pflanzlicher Zellwände bekannt, aber die Rolle von Holzfäulepilzen beim Ligninabbau bietet eine Referenz für die Untersuchung des parasitären Mechanismus von T. chinensis aus der Perspektive endophytischer Pilze. Diese Methode zeigte, dass die Weißfäulepilzstämme die höchste Fähigkeit zum Lignin- und Celluloseabbau aufwiesen35,36,37. In der vorliegenden Studie haben wir endophytische Pilze aus Hauswurzeln verschiedener Wirte isoliert. Diese Stämme wurden zur qualitativen Bestimmung der Enzymaktivitäten von Laccase, Ligninperoxidase, Manganperoxidase und Cellulase ausgewählt. Die Erforschung des Mechanismus der endophytischen Pilze von T. chinensis beim Zellwandabbau während des Parasitenprozesses liefert nicht nur praktische Leitlinien und theoretische Grundlagen für die Vermehrung von T. chinensis, sondern kann auch neue Forschungsideen für die parasitären Mechanismen anderer liefern Parasitäre Pflanzen wie Cuscuta chinensis, Striga asiatica, Cistanche deserticola.

Aus T. chinensis (DC.) Danser, bestehend aus sieben Wirtsarten, wurden insgesamt 147 Stämme isoliert. Dabei handelte es sich um 32 Stämme von Morus alba L., 17 Stämme von Prunus salicina Lindl., 12 Stämme von Diospyros kaki Thunb., 26 Stämme von Dimocarpus longan Lour., 10 Stämme von Phellodendron chinense Schneid., 27 Stämme von Dalbergia odorifera T.Chen und 23 Stämme von Bauhinia purpurea Linn. Insgesamt wurden 72 Stämme mit unterschiedlichen morphologischen Typen ausgewählt und die Aktivitäten des Lignin abbauenden Enzyms und der Cellulase mithilfe der Platten bewertet.

Die Mikroorganismen, die auf dem selektiven Medium mit Guajakol als Indikator einen chromogenen Kreis erzeugen, hatten die Fähigkeit, Lignin abzubauen, und die Hyphen der auf dem Medium wachsenden Laccase-produzierenden Stämme erzeugten eine deutliche rotbraune Färbung. 72 Stämme wurden 11 Tage lang auf Platten mit Guajakol-Selektivmedium kultiviert, und die Verfärbung jeder Platte wurde an den Tagen 3, 5, 7, 9 und 11 beobachtet und aufgezeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass 11 Stämme weder Koloniekreis noch chromogene Kreise aufwiesen. 17 Stämme hatten ein Verhältnis von Koloniekreisdurchmesser zu chromogenem Kreisdurchmesser von weniger als 1. Es gab 26 Stämme mit einem Verhältnis von Koloniedurchmesser zu chromogenem Kreisdurchmesser von mehr als 1. Es gab 7 Stämme mit chromogenen Kreisen, aber ohne Koloniekreise. Es gab 11 Stämme mit Kolonien, aber ohne chromogene Kreise. Laut Referenz38 zeigen Untersuchungen, dass das Verhältnis des Durchmessers des Koloniekreises zum Chromophor verwendet werden kann, um zu beurteilen, ob die Bakterien Lignin selektiv abbauen können. Liegt das Verhältnis unter 1, können die Bakterien Lignin selektiv abbauen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nach einem qualitativen vorläufigen Screening und einem erneuten Screening mit der Guajakol-Methode insgesamt 5 Stämme mit großen und offensichtlichen chromogenen Kreisen aus 24 Pilzstämmen herausgesucht wurden (Pilzstämme mit einem Verhältnis von Koloniekreisdurchmesser zu chromogenem Kreisdurchmesser von weniger). als 1 und Stämme mit chromogenen Kreisen, aber ohne Kolonien) für nachfolgende Enzymaktivitätstests (Tabelle 1). Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass die Kolonien und chromogenen Kreise dieser fünf Pflanzen mit der Wachstumsperiode ebenfalls zunahmen und keine von ihnen bis zum 11. Tag zunahm. Abbildung 1 zeigt das Wachstum der fünf Stämme auf der PDA-Farbplatte nach einem Tag 7.

Wachstumsdiagramme verschiedener Stämme auf der PDA-Farbtafel am 7. Tag. Hinweis: 4 steht für Colletotrichum acutatum; 15 stellt Nigrospora sphaerica dar; 31 stellt Exserohilum rostratum dar; N6 steht für Diaporthe Phaseolorum; P6 steht für Pestalotiopsis arceuthobii.

In Bezug auf die Zellulose-Festmedium-Plattenkultur von 72 Stämmen am Tag 11 ergab die Untersuchung der Platten an den Tagen 3, 5, 7, 9 und 11, dass 14 Stämme keine transparenten Koloniekreise aufwiesen. Das Verhältnis des Koloniedurchmessers zum Durchmesser des transparenten Kreises betrug weniger als 1 bei 58 Stämmen. Die anderen Stämme hatten ein Verhältnis von freiem Koloniedurchmesser zu transparentem Durchmesser von mehr als 1. In ähnlicher Weise wurden Stämme mit dem gleichen Lignin abbauenden Enzym aus Stämmen mit einem Verhältnis von Koloniekreisdurchmesser zu transparentem Kreisdurchmesser von weniger als 1 für den anschließenden Enzymaktivitätstest ausgewählt (Tabelle 2). Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, wurden diese 5 Stämme mit der Zeit allmählich größer und blieben bis zum 9. Tag unverändert, während sie den ursprünglichen Wertebereich beibehielten. Abbildung 2 zeigt das chromogene Wachstum dieser fünf Stämme auf festem Zellulosemedium am Tag 7.

Wachstumsdiagramme verschiedener Stämme auf den Kongo-Rot-Agarplatten am 7. Tag. Hinweis: 4, 15, 31, N6 und P6 repräsentieren Colletotrichum acutatum, Nigrospora sphaerica, Exserohilum rostratum, Diaporthe Phaseolorum bzw. Pestalotiopsis arceuthobii.

Durch Kombination von ITS-rDNA-Sequenzen und Beta-Tubulin-Sequenzen wurde ein phylogenetischer Baum erstellt. Die Ergebnisse (Abb. 3) zeigten, dass die Flecken 4, 15, 31, N6 und P6 mit Colletotrichum sp., Nigrospora sphaerica (CBS MH854879) korrelierten. Exserohilum sp., Diaporthe Phaseolorum (CBS KC343176) und Pestalotiopsis sp.. Diese Arten gehören zum selben Zweig und die Ähnlichkeit beträgt 99–100 %. Daher wurden diese fünf Stämme als Colletotrichum sp., N. sphaerica, Exserohilum sp., D. Phaseolorum bzw. Pestalotiopsis sp. identifiziert. Ein phylogenetischer Baum von fünf Isolaten aus dieser Studie und Sequenzen von GenBank unter Verwendung kombinierter ITS- und TUB2-Gene mit Neighbor-Joining-Methodenanalyse ist in Abb. 3 dargestellt. Der Prozentsatz der Replikatbäume, in denen sich die zugehörigen Taxa im Bootstrap-Test gruppierten (1000). Replikate) wird über den Zweigen angezeigt. Der Baum ist maßstabsgetreu gezeichnet, wobei die Zweiglängen in den gleichen Einheiten sind wie die evolutionären Abstände, die zur Ableitung des phylogenetischen Baums verwendet wurden. Die evolutionären Abstände wurden mit der p-Abstandsmethode berechnet und sind in der Einheit der Anzahl der Basisunterschiede pro Standort angegeben. Alle Taxa waren in fünf Clustern verteilt, nämlich dem Stamm Ascomycota innerhalb von fünf Ordnungen und fünf Gattungen. Stamm P6 bildete eine unterstützte Klade, die mit Stamm 15 schloss. Die Stämme N6 und 4 bildeten eine unterstützte Klade (98 % Bootstrap-Unterstützung), die mit den Stämmen P6 und 15 schloss. Sequenzen dieser fünf Stämme wurden an die GenBank-Datenbank und den Beitritt übermittelt Die erhaltenen Zahlen (ITS und Beta-Tubulin) sind MZ2823601/MZ964759, MZ2823600/MZ934421, MZ2823597/MZ934418, MZ2823599/MZ934420 bzw. MZ2823598/MZ934419.

Phylogenetischer Baum, der auf der Grundlage von ITS-rDNA- und Beta-Tubulin-Sequenzen erstellt wurde. An den Knoten werden Bootstrap-Werte > 50 % (1000 Replikation) angegeben. Als Außengruppe wurde Gaertneriomyces semiglobiferus verwendet.

Wie aus Abb. 4A ersichtlich ist, lag der Höhepunkt der Laccase-Produktion dieser fünf Stämme am 7. Tag und begann ab Tag 9 zu sinken. Die Laccase-Produktionskapazität der 5 Stämme war signifikant (P < 0,05). Unter ihnen Pestalotiopsis sp. hatten die stärkste Laccase-Produktionskapazität (117,66 U/ml), gefolgt von D. Phaseolorum, N. sphaerica und Exserohilum sp. (51,82, 32,11 bzw. 21,85 U/ml) und Colletotrichum sp. hatte die schwächste Laccase-Produktionsaktivität (9,76 U/ml). Die Reihenfolge der Enzymaktivitäten der fünf Stämme war Pestalotiopsis sp. > D. phaseolorum > N. sphaerica > Exserohilum sp. > Colletotrichum sp.

Variationen relevanter Enzymaktivitäten, die von verschiedenen endophytischen Pilzen im Laufe der Zeit während des Lignin- und Celluloseabbaus erzeugt werden: (A) Laccase-Aktivität; (B) Manganperoxidase-Aktivität; (C) Ligninoxidase-Aktivität; (D) Cellulase-Aktivität.

Wie in Abb. 4B gezeigt, ist der höchste Wert der Manganperoxidase-Produktion durch Colletotrichum sp. betrug 7 Tage mit einer Enzymaktivität von 11,61 U/ml, gefolgt von D. Phaseolorum und Exserohilum sp. mit den höchsten Enzymaktivitäten von 8,47 bzw. 5,58 U/ml. Andererseits sind N. sphaerica und Pestalotiopsis sp. hatten am 11. Tag die höchste Enzymproduktionskapazität und die Enzymaktivitäten betrugen 8,59 bzw. 6,79 U/ml.

Wie in Abb. 4C gezeigt, sind die Ligninperoxidase-Aktivitätskurven von D. Phaseolorum, Colletotrichum sp., Exserohilum sp. alle nahmen im Laufe der Zeit zunächst zu, erreichten den Höhepunkt der Enzymaktivität und begannen dann abzunehmen. Die höchste Ligninperoxidase-Produktionskapazität dieser drei Stämme lag nach 7 Tagen und die Enzymaktivitäten betrugen 6,64, 3,0 bzw. 2,9 U/ml. Die Ligninperoxidase-Aktivitäten von Pestalotiopsis sp. und N. sphaerica stiegen zunächst an, sanken dann ab und begannen am 11. Tag wieder anzusteigen, wobei die höchsten Enzymaktivitäten 4,21 bzw. 3,4 U/ml betrugen. Die Reihenfolge der Ligninperoxidase-Aktivität der fünf Stämme war D. Phaseolorum > Pestalotiopsis sp. > N. sphaerica > Colletotrichum sp. > Exserohilum sp., und die Werte der Enzymaktivitäten bei den niedrigsten und höchsten Werten der fünf Stämme waren signifikant unterschiedlich (P < 0,05).

Aus Abb. 4D ist ersichtlich, dass die Celluloseenzymaktivitäten der vier Stämme Pestalotiopsis sp., D. phaseolorum und Exserohilum sp. und Colletotrichum sp. zunächst ansteigen, bis am Tag 5 ein Maximum erreicht ist, und dann abfallen. Bei N. sphaerica ist jedoch am 5. Tag ein plötzlicher Rückgang und am 7. Tag ein Anstieg und anschließend ein Rückgang zu beobachten. Bei allen fünf Stämmen war die Cellulaseproduktion am Tag 7 am höchsten. Die Cellulaseaktivitäten betrugen 1,66, 1,11, 0,67, 0,61 und 0,59 U/ml am Tag 7 in Pestalotiopsis sp., D. phaseolorum, Exserohilum sp., Colletotrichum sp. bzw. N. sphaerica.

Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, wurde bei den Stämmen mit Enzymen, die die Zellwand abbauen, täglich mit Fermentationsflüssigkeit besprüht, und es wurde festgestellt, dass die Parasitismusraten dieser drei Stämme alle in unterschiedlichem Maße verbessert waren, darunter auch der Stamm P. arceuthobii hatten die beste Parasitismusrate und erreichten 17 %, deutlich höher als die Kontrolle. Zellwandabbauende Enzyme, die von endophytischen Pilzen produziert werden, tragen zum Parasitismus von T. chinensis bei.

Enzyme, die mit dem Zellwandabbau in Zusammenhang stehen, spielen dabei eine wichtige Rolle, und endophytische Pilze sind eine der Quellen dieser Enzyme. Daher wurden in dieser Studie fünf endophytische Pilze mit Enzymen, die die Zellwand stark abbauen, von 147 endophytischen Pilzen aus Taxillus chinensis-Zweigen verschiedener Wirte untersucht. Die fünf endophytischen Stämme waren Colletotrichum sp., Nigerrospora sphaerica, Exserohilum sp., Diaporthe Phaseolorum bzw. Pestalotiopsis sp. Gleichzeitig haben wir auch 47 endophytische Pilze aus verschiedenen Wirtszweigen isoliert (Ergänzungstabelle 1). Zusätzlich zu Morus alba wurden endophytische Pilze der anderen sechs Wirtszweige sequenziert und in GenBank auf Colletotrichum sp., Nigerrospora sp., Diaporthe sp. und Pestalotiopsis sp. Es bedarf jedoch weiterer Forschung, um festzustellen, ob diese Pilze auch diese zellwandabbauenden Enzyme produzieren können und ob sie den Parasitismus von T. chinensis fördern können. Es gibt viele Arten von Enzymen, die die Zellwand abbauen. In dieser Studie wurden vier Arten von zellwandabbauenden Enzymen gemessen, darunter Ligninperoxidase, Manganperoxidase sowie Laccase und Cellulose. Wir haben versucht, diese endophytischen Pilze mit einer hohen Ausbeute an vier Enzymen zur Durchführung einer Fermentationsbrühenkultur zu verwenden und haben die Fermentationsbrühe des Stamms mit hoher Enzymaktivität ausgewählt, um T. chinensis-Samen täglich auf Zweige von Morus alba zu sprühen und die Maulbeerparasitenrate zu berechnen , 5 % höher als die Kontrolle (dieser Teil des Experiments ist noch eine wiederholte Überprüfung und Statistik). Zusätzlich zu diesen Enzymen zeigte die Analyse zuvor veröffentlichter RNA-seq-Daten, dass bestimmte Gene, die für Xyloglucan-Endoglucase/Hydrolasen und Pektinmethylesterasen, Polygalacturonasen und Cellulase-ähnliche Enzyme in Cuscuta campestris kodieren,6,7,15,39,40. Studien haben gezeigt, dass die Endoglykosylierung von Xyloglucan am deutlichsten in der Zellwand der Erweiterungsregion des Haustoriums in Richtung der Wirtspflanze auftritt, aber auch in späteren Stadien der Entwicklung des Haustoriums nachgewiesen werden kann39. Diese Daten bestätigen, dass die haustoriale Invasion von Cuscuta-Arten nicht nur durch mechanische Einwirkung, sondern auch durch spezifischen biochemischen Abbau und Modifikation der Wirtszellwand erleichtert wird3,40. Diese Forscher vermuten, dass Enzyme, die am Abbau und der Modifizierung der Umgestaltung der Wirtszellwände in Cuscuta-XTHs beteiligt sind, den Parasiten auf eine Wirtsinfektion vorbereiten und zum invasiven Haustralwachstum beitragen können39. Daher bedarf die weitere experimentelle Überprüfung der Frage, ob diese Enzyme auch im dominanten Pilz vorkommen, der aus verschiedenen Wirten und in T. chinensis isoliert wurde, und ob diese Enzyme den Haustorium-Parasitismus im Wirt fördern können.

In dieser Studie wurde Weizenkleie als Substrat der Ligninfaserbiomasse für die Fermentation ausgewählt und die Aktivitäten von Laccase, Manganperoxidase, Ligninperoxidase und Cellulase zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt. Es wurde festgestellt, dass die maximale Aktivitätszeit der fünf Stämme, die Laccase und Cellulase produzieren, 7 Tage betrug, und die höchsten Aktivitäten von Laccase und Cellulase wurden bei Stamm P6 gefunden, die bei 117,66 bzw. 1,66 U/ml lagen. Pestalotiopsis sp. wurde anhand ihrer morphologischen und molekularbiologischen Eigenschaften identifiziert. Es wurde berichtet, dass Pestalotiopsis sp. Pilze können relativ hohe Laccase- und Celluloseaktivitäten erzeugen und Waldabfälle effektiv abbauen41. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Farbe von Fermentationsbrühe-Extrakten von Pestalotiopsis sp. war deutlich leichter als die der anderen vier Sorten. Dies liegt daran, dass Laccase bei der Entfärbung und Zersetzung von Kraftstoffen eingesetzt werden kann und möglicherweise gegen Strategien zur globalen Erwärmung eingesetzt werden kann42,43. Pestalotiopsis sp. produzierte die höchste Laccase-Aktivität von 117,66 U/ml, was im Vergleich zu den derzeit gemeldeten ungereinigten Rohenzymaktivitäten ein relativ hoher Wert war, und seine Produktion hing nicht von der Zugabe einiger induzierbarer Faktoren wie einer Bodentemperatur von 80 °C ab. Ferulasäure, Cu2+ oder Dimethylanilin. Darüber hinaus wurde von Cao et al.44 berichtet, dass die Enzymaktivität von Laccase bei Zugabe einer Bodentemperatur von 80 °C und eines Cu2+-Induktors innerhalb einer Woche nach dem Wachstum tatsächlich viel höher war. Mit Ausnahme des Weißfäulepilzes Ganoderma applanatum erreichte der Durchschnittswert der Laccase-Aktivität der anderen beiden Weißfäulepilze (Trametes hirsuta und Fomes fomentarius) jedoch nicht ihre Spitzenwerte. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Pestalotiopsis sp. ist ein relativ wirksamer Laccase produzierender Stamm.

Die Spitzenaktivitäten der Mangan- und Ligninperoxidasen von D. phaseolorum, Colletotrichum sp., N. sphaerica und Exserohilum sp. erschien ebenfalls am Tag 7, aber der zweite Höhepunkt der Manganperoxidase-Aktivitäten der Stämme N. sphaerica und Pestalotiopsis sp. am Tag 11 lagen sie bei 8,59 bzw. 6,79 U/ml. Die Enzymaktivitäten der Ligninperoxidase betrugen 3,4 bzw. 4,21 U/ml, was mit den Berichten über Lignase und Cellulase einiger Weißfäulepilze übereinstimmt45,46,47. Der zweite Peak könnte auf die Freisetzung der entsprechenden intrazellulären Enzyme zurückzuführen sein, die ursprünglich aufgrund der Autolyse der Hyphen an die Zellmembranen gebunden waren41. Die vier Stämme N6, 4, 15 und 31 wurden anhand ihrer morphologischen und molekularbiologischen Eigenschaften als D. phaseolorum, Colletotrichum sp., N. sphaerica bzw. Exserohilum sp. identifiziert. Dies ist der erste Bericht über vier Pilze, die unter Verwendung von Weizengluten-Faserbiomasse als Substrat Lignozellulose abbauende Enzyme produzieren. Einige frühere Studien haben auch die Aktivitäten von Laccase, Ligninperoxidase, Manganperoxidase und Cellulase untersucht, die von Pilzen von sechs weniger verbreiteten Pilzen (Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp., Tricherderma sp., Pestalotiopsis sp. und Aspergillus fumigates) produziert werden. während des Abbaus von Masson-Kiefernlaubstreu41.

Der Abbau von Lignin und Cellulose ist nicht von einem einzelnen Enzym abhängig, sondern das Ergebnis des Zusammenspiels mehrerer Enzyme. Ligninabbauenzyme bestehen hauptsächlich aus drei Enzymen: Ligninperoxidase, Manganperoxidase und Laccase48. Darüber hinaus hängt die Größe des Farbkreises zwangsläufig mit dem Grad der Laccase-Aktivität zusammen, es besteht jedoch keine positive lineare Korrelation zwischen diesen beiden Parametern49. Celluloseabbauende Enzyme bestehen hauptsächlich aus einer Endoglucanase, einer Exoglucanase und β-Glucosidase, und die synergistische Wirkung dieser drei Enzyme ist für die vollständige Hydrolyse von Cellulose in Monosaccharide erforderlich50,51,52.

Im Januar 2020 wurden die Wurzeln von T. chinensis verschiedener Wirte, darunter M. alba, P. salicina, P. chinense, D. odorifera, B. purpurea, D. kaki und D. longann, in der T. chinensis-Pflanzbasis gesammelt des Dorfes Cenxi Funing, Stadt Wuzhou (111° 51′ 14″ E, 22° 58′ 12″ N). Wir haben 3–5 Haustorien von T. chinensis von denselben Wirtspflanzen gesammelt.

Die Weizenkleie wurde von der Zhonghe Modern Agricultural Development Group Co. Ltd. gekauft. Die Vorbehandlung der Weizenkleie basierte mit einigen Modifikationen auf der Methode von Tao Yanjuan53. Die Weizenkleie wurde durch ein 40-Mesh-Sieb zerkleinert, dann wurde das 10-fache Volumen destilliertes Wasser zugegeben und die Mischung 25 Minuten lang mit einer Kolloidmühle zerkleinert. Die flüssigen Verunreinigungen wurden mit einem 150-Mesh-Sieb herausgefiltert und die festen Teile wurden 24 Stunden lang in einem Ofen bei 60 °C getrocknet und anschließend zerkleinert. Das zehnfache Volumen destilliertes Wasser wurde zugegeben und 30 Minuten lang auf 95 °C erhitzt. 1 M Salzsäure wurde verwendet, um den pH-Wert auf 5,6 einzustellen, und 1,5 % (Gew./Gew.) hochtemperaturbeständige α-Amylase wurden zugegeben. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 95 °C gerührt und die vollständige Reaktion wurde mit Jodlösung nachgewiesen. Die Temperatur wurde auf 50 °C gesenkt und der pH-Wert mit NaOH auf 9,0 eingestellt. 3 % (Gew./Gew.) alkalische Protease wurden zugegeben und die Reaktion wurde 2 Stunden lang gerührt, dann wurde der Überstand verworfen, filtriert und durch einen 150°C gespült -Maschensieb in klarem Wasser, bis die Trübung der gewaschenen Lösung verringert war, und die verbleibenden Feststoffe wurden 24 Stunden lang in einem Ofen bei 60 °C getrocknet. Die Weizenkleie wurde durch Trocknen gewonnen und mit einer Mikromühle zerkleinert, mit 100 Mesh gesiebt, in einem Ofen mit konstanter Temperatur bei 50 °C über Nacht getrocknet und dann gelagert. Der Zweck der Vorbehandlung besteht darin, Stärke und Protein aus Weizenkleie zu entfernen. Auf diese Weise werden als Hauptbestandteil der Weizenkleie-Ballaststoffe unlösliche Ballaststoffe gewonnen.

Das PDA-Medium bestand aus 200 g/L Kartoffel, 20 g/L Glucose und 20 g/L Agar. Der pH-Wert betrug 7,0 und es wurde 30 Minuten lang bei 1 × 105 Pa sterilisiert. Das flüssige Saatmedium bestand aus 20 g/L Glucose, 2 g/L Hefeextrakt, 3 g/L KH2PO4, 1,5 g/L MgSO4·7H2O und 0,5 g/L VB1. Der pH-Wert war neutral und es wurde 30 Minuten lang bei 1 × 105 Pa sterilisiert. Festes Medium mit Guajakol bestand aus 200 g/L Kartoffel, 20 g/L Glucose, 20 g/L Agar, 3 g/L KH2PO4, 1,5 g/L MgSO4·7H2O, 0,02 g/L VB1 und 1 g/L Guajakol. Der pH-Wert war neutral und es wurde 30 Minuten lang bei 1 × 105 Pa sterilisiert. Das Grundmedium für die Flüssigfermentation bestand aus 30 g/L Weizenkleie, 3 g/L KH2PO4, 1,5 g/L MgSO4·7H2O, 1,4 g/L (NH4)2SO4, 0,3 g/L CaCl2, 5 mg/L FeSO4· 7H2O, 1,6 mg/L, MnSO4·H2O und 0,02 g/L VB1. Der pH-Wert war neutral und es wurde in dreieckige 250-ml-Kolben bzw. 100 ml pro Flasche aufgeteilt und 30 Minuten lang bei 1 × 105 Pa sterilisiert. Das feste Cellulosemedium54 bestand aus 5 g/L Natriumcarboxymethylcellulose, 0,5 g/L Hefeextrakt, 0,5 g/L Pepton, 0,3 g/L, Rindfleischextrakt, 3 g/L, KH2PO4, 5 g/L K2HPO4, 2 g /L, (NH4)2SO4, 0,4 g/L MgSO4, 0,1 g/L CaCl2, 1 ml einer Spurenelementlösung, 20 g/L Agarpulver und 0,5 g Kongorotpulver, gelöst in 50 ml sterilem Wasser. Die Spurenelementlösung bestand aus 0,07 g/L ZnCl2, 0,1 g/L MnCl2·4H2O, 0,06 g/L H3BO3, 0,2 g/L CoCl2·6H2O, 0,02 g/LCuCl2·2H2O, 0,02 g/L NiCl2·6H2O, 0,04 g/L NaMoO4·2H2O und 1 ml/L Salzsäure.

Es wurden gesunde und krankheitsfreie Haustorien von T. chinensis aus verschiedenen Wirten ausgewählt und die Gewebe in 5 cm große Fragmente geschnitten. Diese Proben wurden mit Leitungswasser gewaschen und natürlich getrocknet. Die Oberflächen wurden nacheinander 2,5 Minuten lang mit 75 % Ethanol und 0,1 % HgCl2 desinfiziert und dreimal mit sterilem Wasser gewaschen55. Mit sterilen Pinzetten und Skalpellen wurden sie in etwa 5 mm große Gewebeblöcke geschnitten und dann auf PDA-Platten (Medium mit Streptomycin) mit 5 Blöcken pro Platte und 3 Platten pro Probe gelegt. Die Kulturen wurden bei 28 °C gehalten, bis das Myzel vom Rand der Gewebeblöcke wuchs, und dann wurden diese zur Reinigung und Konservierung auf PDA-Platten übertragen.

Für das erste Screening auf Lignin abbauende Enzyme wurde 0,1 % Guajakol-PDA-Medium zugesetzt56. Nach der Reinigung wurden Fuangalblöcke mit einem Durchmesser von 6 mm ausgewählt und auf den Platten auf einer superreinen Plattform platziert, mit 3 Replikaten für jeden Stamm, und diese wurden 10 Tage lang bei 28 °C kultiviert. Die Durchmesser der Kolonien und Farbkreise innerhalb der Platte wurden beobachtet und statistisch analysiert, ebenso wie etwaige Veränderungen in der Koloniefarbe.

Das primäre Screening von cellulolytischen Enzymstämmen wurde mit der folgenden Methode durchgeführt. Die Gewebeblöcke (6 mm Durchmesser) der gereinigten Stämme wurden zusammen mit dem festen Cellulosemedium auf das Kulturmedium geimpft. Für jede Gruppe wurde dies dreimal wiederholt und dann 10 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Die Zellen wurden 15 Minuten lang mit 0,1 % Kongorot gefärbt und dann 15 Minuten lang mit 1 M NaCl entfärbt. Einheit transparenter Kreisdurchmesser = transparenter Kreisdurchmesser − Koloniedurchmesser. Es wurde angenommen, dass die Enzymproduktionsaktivität umso höher ist, je größer der Durchmesser des transparenten Kreises ist54.

Die Lignincellulose abbauenden Enzymstämme mit chromogenen und transparenten Ringen wurden gemäß der oben genannten Methode gescreent.

Die lignocelluloseabbauenden Stämme mit chromogenen und transparenten Ringen wurden für 5–7-Tage-Kulturen ausgewählt und diese jeweils quantitativ inokuliert. 10 ml der geschüttelten Saatflüssigkeit wurden in einen 250 ml fassenden Dreieckskolben gegeben, der 100 ml flüssiges Fermentationsmedium enthielt. Jeder Stamm wurde in 2 Flaschen beimpft, und 5 Stammblöcke mit 6 mm Durchmesser wurden in dieselbe Flasche gegeben. Diese wurden 11 Tage lang in einem Schüttler mit konstanter Temperatur bei 26 °C und 140 U/min inkubiert. Ab dem vierten Tag der Flüssigkultur wurden einmal täglich Proben entnommen. Die Fermentationsflüssigkeit wurde mit vier Lagen Gaze filtriert und das Filtrat 15 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert. Die Überstände waren die rohe Enzymflüssigkeit.

Die Koloniemorphologie wurde unter Bezugnahme auf die Methode von Fang Zhongda52 aufgezeichnet, und dieser Parameter wurde zunächst unter Bezugnahme auf die Methode von Wei Jingchao57 identifiziert. Seine rDNA (ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ und ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) und Beta-Tubulin (βT-2a) 5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′ und Beta-Tubulin (βT-2b) 5′-ACCTCAGTGTAGTGACCTTGGC -3′) wurden zur molekularbiologischen Identifizierung verwendet58,59. Das Mightyamp DNA Polymerase Ver.3 (1,25U/50μL) Kit (Takara Bio Inc., Japan, Kat.-Nr. R076A) wurde verwendet, um endophytische Pilzhyphen als Matrizen für die PCR-Reaktion auszuwählen. Alle PCR-Reaktionen wurden in 50-µL-Volumina durchgeführt, die 1x PCR-Puffer, 0,2 mM Konzentrationen jedes dNTP, 4 mM MgCl2, 0,5 µM Konzentrationen jedes Primers, 0,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Takara) und 1 µL Tem enthielten -Platten-DNA (20 ng/µL). Das PCR-Programm für TUB2 umfasste einen Denaturierungsschritt bei 94 °C für 2 Minuten, gefolgt von 35 Zyklen bei 94 °C für 45 Sekunden, 60 °C für 45 Sekunden und 72 °C für 1 Minute sowie einen letzten Zyklus bei 72 °C °C für 10 Min. Das PCR-Programm für die ITS-Region umfasste einen 2-minütigen Denaturierungsschritt bei 94 °C, gefolgt von 34 Zyklen bei 94 °C für 1 Minute, 55 °C für 30 Sekunden und 72 °C für 1 Minute sowie einen letzten Zyklus 10 Min. bei 72 °C. Die Zielbanden wurden mithilfe der Gel-Bildgebungsmethode nachgewiesen und die PCR-Produkte der Zielbanden wurden zur Sequenzierung an BGI (Guangzhou) Co. Ltd. gesendet. Die Sequenzierungsergebnisse wurden mithilfe von BLAST mit den Sequenzen in der NCBI GenBank verglichen. Sequenzabgleiche jedes Gens und der kombinierten Gene wurden mit ClusstalX Version 1.83 durchgeführt. Der phylogenetische Baum des ITS- und Tubulin-Gens wurde unter Verwendung der Neighbor-Joining-Methode mit der Software MEGA 7.060 erstellt.

Die Enzymaktivität von Laccase wurde unter Verwendung von ABTS als Substrat61 gemessen, das als die Enzymmenge definiert wurde, die für die katalytische Oxidation von 1 μmol Substrat ABTS bei 30 °C pro Minute als Einheit der Laccaseaktivität erforderlich ist. Die Oxidation des Substrats ABTS wurde durch Messung des Lichtabsorptionswerts der Reaktionslösung bei 420 nm und unter Verwendung eines molaren Extinktionskoeffizienten von 36.000 mol−1 cm−1 bestimmt. Die Aktivität der Ligninperoxidase wurde unter Verwendung von Veratrol als Oxidationssubstrat zur Herstellung von Veratrol bei 30 °C62 gemessen. Eine Einheit der Enzymaktivität wurde als die Änderung des Absorptionswerts von 0,1 Einheiten pro ml der Reaktionslösung pro Minute definiert. Die Aktivität der Manganperoxidase wurde mit der Phenolrot-Methode63 gemessen. Eine Einheit der Enzymaktivität wurde als Anstieg des Lichtabsorptionswerts pro ml der Reaktionslösung bei 610 nm um 0,1 Einheiten definiert, ausgedrückt als U mL−1.

Die Cellulaseaktivität wurde unter Verwendung eines Cellulase (CL)-Aktivitätsnachweiskits (Beijing Solaibuo Technology Co., Ltd.) und der 3,5-Dinitrosalicylsäure (DNS)-Methode bestimmt. Unter der Wirkung von Cellulase wird Cellulose zu einem reduzierenden Zucker abgebaut, und die Menge des reduzierenden Zuckers wurde bestimmt, um die Enzymaktivität zu bestimmen. Aus dem Kit wurde 1 ml hochreines Wasser zu 10 mg wasserfreiem Glucosestandard gegeben (Trockengewichtsverlust < 0,2 %), um eine 10 mg mL−1 Glucoselösung herzustellen, die dann in 1,0, 0,8, 0,6, 0,4 verdünnt wurde. 0,2, 0,1 und 0 mg mL−1 durch Gradientenverdünnung. Diese wurden bei 540 nm abgelesen, um eine Standardkurve zu erstellen. 1 ml Fermentationsflüssigkeit wurde abgewogen und die Pilze in einem Ultraschall-Eisbad lysiert. Die Überstände wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 8000 g zentrifugiert und 2 ml der rohen Enzymflüssigkeit in Zentrifugenröhrchen wurden zur Messung auf Eis gestellt. Das Reaktionssystem bestand aus 350 μl Substrat und 50 μl Probe. Nach der Reaktion wurde die Verzuckerungslösung durch Kochen gewonnen, um die Reaktion abzubrechen. 50 μl der Verzuckerungslösung wurden entnommen und 150 μl DNS-Reagenz hinzugefügt und gemischt. Dann wurden 1050 μl doppelt destilliertes Wasser hinzugefügt, um die Absorption bei 540 nm unter dem UV-Spektrophotometer64,65 zu messen.

Die vorbereitete Fermentationsflüssigkeit wurde bis zum 20. Tag täglich mit T. chinensis-Samen besprüht, die auf Morus alba parasitiert waren, und Wasser und Flüssigkeit ohne Zusatz endophytischer Pilzstämme wurden als Kontrolle verwendet. Die Parasitierungsrate wurde alle 10 Tage bis 60 Tage berechnet und die endgültige Parasitierungsrate wurde berechnet. Die Parasitierungsrate basierte darauf, dass Haustorium vollständig in den Wirt gelangte. Die Fermentationsflüssigkeit ist die gleiche wie oben (Flüssige Enzymzubereitung).

Statistische Ergebnisse wurden als x ± s ausgedrückt, wobei ± der Mittelwert und s die Standardabweichung ist. Die Software SPSS19.0 wurde verwendet, um eine univariate ANOVA-Analyse und den Varianzhomogenitätstest für Daten in jeder Gruppe durchzuführen. P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81960695, 82173933, 81703649 und 81860672) und der Guangxi Natural Science Foundation of China (Nr. 2021GXNSFBA075037, 2018GXNSFAA281089, 2017GXNSFDA198026 und) unterstützt 2016GXNSFDA380012), Guangxi Botanischer Garten für Heilpflanzen Projekt zum Aufbau von Forschungs- und Innovationsteams (Nr. GYCH2019008) und das Projekt zur Finanzierung wissenschaftlicher Forschung des Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants (Nr. GYJ202012). Die Autoren danken außerdem Dr. Dev Sooranna vom Imperial College London für die englischsprachige Bearbeitung des endgültigen Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Lisha Song und Limei Pan.

Guangxi Botanischer Garten für Heilpflanzen, Nanning, 530023, China

Lisha Song, Limei Pan, Ni Jiang, Jine Fu, Lingyun Wan und Shugen Wei

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Überprüftes und fertiggestelltes Manuskript, SGW und JEF, Abschluss des Schreibens des Artikels, LSS und LMP, Integration und Analyse der Daten in den Tabellen und erstellten Abbildungen: NJ und Überwachung des fertigen Manuskripts: LYW

Korrespondenz mit Jine Fu, Lingyun Wan oder Shugen Wei.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Song, L., Pan, L., Jiang, N. et al. Auswirkungen endophytischer Pilze auf den parasitären Prozess von Taxillus chinensis. Sci Rep 12, 7744 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11940-z

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Eingegangen: 16. November 2021

Angenommen: 29. April 2022

Veröffentlicht: 11. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11940-z

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